2018, Vol. 13
2. 安徽医科大学微生物学教研室, 合肥 230032
2. Department of Microbiology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
核酸适配体又称核酸适体，或称适配子，是一段能与靶分子特异性结合的单链核酸分子，可为DNA或RNA。1990年，Tuerk和Gold[1]发明了从寡核苷酸文库中筛选与噬菌体DNA聚合酶特异性结合的RNA序列的技术，即指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术。同年，Ellington等[2]利用SELEX技术筛选到了与染料分子汽巴克隆蓝(cibacron blue)、活性蓝4(reactive blue 4)结合的RNA序列，并将这种具有特异性结合能力的寡核苷酸序列命名为“aptamer”，即核酸适配体。
核酸适配体的形成，首先要在单链核酸序列的基础上形成茎环、发卡或G-四链体等二级结构，再通过内部碱基配对、形成氢键及静电作用等形成空间结构。核酸适配体与靶分子的结合主要依靠非共价键相互作用，如范德华力、氢键、芳环堆积和静电相互作用等实现。在与靶分子结合的特异性和亲和力上，核酸适配体足以与抗体媲美，因此也有“化学抗体”的美誉。目前，核酸适配体在物质检测、分子成像、靶向治疗和疾病诊断等生物医学多个领域展现出极大的应用潜力。2009年北京香山科学会议上，国内学者以“核酸适配体及生物医学应用”为主题展开讨论，与会专家一致认为核酸适配体生物医学应用领域方兴未艾，应抓住机遇，推动我国在核酸适配体生物医学领域及应用方面的研究[3]。国内学界对核酸适配体的关注也因此进一步提升。本文就核酸适配体在感染性疾病诊治方面的应用进展进行综述。
1 SELEX技术和核酸适配体的特性SELEX技术本质上是一种在体外模拟自然进化的定向进化技术，其原理是先构建寡聚核苷酸文库，将靶分子与文库中的众多核酸序列一同孵育，随后通过硝酸纤维素滤膜结合、电泳或磁性分离等方法，将与靶分子结合的序列与非结合序列分开，再利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)(获取DNA适配体时使用)或反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)(获取RNA适配体时使用)扩增与靶分子亲和的核酸序列，获得经过富集后的“子代”核苷酸文库。重复上述过程，经过多轮筛选后，即可获得能与靶分子高度亲和的核酸片段，通常在获取目标序列后，会对其进行测序，评估其与靶分子的结合能力[4-5]。SELEX技术决定了核酸适配体靶分子的广泛性，其范围涵盖从金属离子、化合物、多肽、核酸、蛋白质到细胞的巨大区间，甚至包括了某些复杂靶标，如病毒、细菌等病原体。而基于SELEX技术，以病原体的某些特异性或关键性物质为靶标，如表面蛋白或完成生理过程必需的关键酶等，获取相应的核酸适配体，有望用于病原体诊断或感染的治疗。
在此方面，核酸适配体与抗体的功能较为类似。但在检测方面，对那些尚未掌握其特定标记的病原体，还无法利用抗体进行检测。利用SELEX技术，可将病毒、细菌等病原体为靶标进行筛选，获取针对病原体上未知特异性结构的核酸适配体，而无需事先知晓其标记[6]。在这一点上，核酸适配体具有抗体无法比拟的优势。除在靶分子范围方面优于抗体，核酸适配体本身为核酸，这也赋予了它众多优良特性，如与蛋白质相比，核酸性质更加稳定，可耐受较大范围的酸碱度、温度和较广泛的有机溶剂，便于存储；核酸适配体相对分子质量较抗体更小，有良好的组织穿透能力，免疫原性较低，不易引起机体的免疫反应；可在体外筛选，通过化学方法进行大量可重复、低成本的合成，且各批次间无差异；易于修饰改造，能连接不同的基团，实现与各种载体的结合等。
得益于其优良的理化特性，核酸适配体在医学诊断和疾病治疗方面具有巨大的应用前景。在如今病原体变异和新型病原体感染高发的情况下，核酸适配体可能提供了一种良好的应对解决策略。
2 核酸适配体在感染性疾病病原学诊断中的应用感染性疾病的病情进展大多较快，有效的治疗往往要以明确的诊断为前提，因此早期和精确的诊断具有重要意义。目前，临床上采用的病原体检测方法主要有3类：一类是在患者的相应样本中借助显微镜或电子显微镜等直接寻找病原体或做病原体培养；第二类为以PCR为代表的分子生物学诊断技术；第三类是以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)为代表的免疫学诊断技术。
直接寻找或培养病原体对样本要求高，培养周期长，在应用上有较大限制。利用PCR等分子生物学技术检测病原体核酸具有极高的灵敏度，但对仪器和试剂保存条件、环境的要求高，容易因实验污染而出现假阳性，检测成本也较高。ELISA等免疫学方法在临床上使用较多，主要检测病原体抗原或机体内针对病原体的抗体，其在检测灵敏度、成本和检测速度上整体较好，因而被普遍应用。但对某些服用免疫抑制剂、免疫功能低下及处于感染早期和窗口期的患者，其机体内可能不会出现特异性抗体，这是通过检测抗体进行诊断的免疫学方法无法回避的问题[7]。再者，ELISA必须基于清楚知晓检测对象的特异性标记(特异性抗原或抗体)方能成立。
针对上述问题，基于核酸适配体的检测能给出较好的解决方案。核酸适配体对靶分子的特异性极高，且靶分子范围极广，其靶标不仅可以是抗体等晚期标记，也可以是病原体核酸、表面蛋白等早期标记，这为早期检测病原体创造了条件。核酸适配体在确定序列后，可通过化学方法批量制备，由于性质稳定，其后续存储也较方便，整体成本低。综合来看，核酸适配体在病原体检测中是大有可为的。
2.1 病毒感染的检测目前，核酸适配体可检测病毒已有很多报道，包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、人乳头瘤病毒、部分肝炎病毒、部分流感病毒和埃博拉病毒等[8]。Xi等[9]经过13轮筛选，获取了针对乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)的核酸适配体，并结合磁性分离和免疫分析技术构建了一种化学发光核酸适配体传感器。其对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)具有极高的特异度和检测精度，在有干扰物质存在时，对HBsAg的检测灵敏度仍达到0.1 ng/mL。流感病毒感染性强，其基因易突变，几乎每一种新亚型流感病毒刚出现时都会引发局部甚至全球范围的流感大流行。对控制疾病流行和疾病治疗而言，早期确诊流感病毒感染十分关键。Tseng等[10]基于微流体技术，构建了一套诊断甲型H1N1流感病毒的双核酸适配体荧光检测系统，其对病毒具有高度特异性和亲和力，检测灵敏度较现有商品化的流感快速诊断试验(rapid influenza diagnostic test)高出约30倍，检测时间也只需30 min左右。同时，得益于微流体技术，这种检测仅需极其微量的样本和试剂即可完成，大大降低了检测成本和对样本的要求。该研究组后续还利用荧光修饰的通用性核酸适配体结合微流体技术，开发了可检测甲型H1N1流感、甲型H3N2流感、乙型流感病毒(influenza B virus)这3种病毒的通用检测系统，检测时间仅需20 min，远低于常规检测方法[11]。
2.2 细菌感染的检测利用核酸适配体对细菌进行检测已有诸多报道，可检测的细菌包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、空肠弯曲杆菌、溶血性链球菌、志贺痢疾杆菌及铜绿假单胞菌等。这些检测体系均具有极高的检测灵敏度，部分检测灵敏度可达1~10 CFU/mL[12-13]。以金黄色葡萄球菌检测为例，Abbaspour等[14]创建了一套基于电化学传感器的双核酸适配体夹心检测体系，即先将生物素化的核酸适配体固定在亲和素标记的磁珠上构成捕获探针，再用另一种核酸适配体与银纳米颗粒缀合构成检测探针。检测时，待测样本中的金黄色葡萄球菌可结合900~1 200个捕获探针和1 500~2 300个检测探针，使得该体系检测低限达到1 CFU/mL，远超常规检测方法。
2.3 检测被感染细胞表面的标记除直接检测病原体组分和抗体外，核酸适配体还可提供一种独特的检测方式，即检测被病原体感染的细胞。较之于正常细胞，癌变或被病原体感染的细胞表面分子往往会发生一些特征性改变，由此产生的某些标记可作为核酸适配体识别的靶标，用于疾病诊断。此种类型的诊断方式目前主要用于核酸适配体对肿瘤性疾病的诊断，诊断寄生虫感染也有报道[15-16]。Parekh等[17]和Tang等[18]利用SELEX技术，以病毒感染细胞表面的糖基化血凝素为靶标，成功筛选出了能特异性识别牛痘病毒感染细胞的核酸适配体，使用荧光染料标记核酸适配体后，可在荧光显微镜下直接检测。这种检测方式流程简单，有望用于某些病原体的快速诊断。
3 核酸适配体在感染性疾病治疗中的研究进展由于抗生素的滥用，耐药菌株大量出现，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及多重耐药的铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌等。面对这些耐药菌株引起的感染与相应临床疾病，临床医师往往束手无策。病毒由于基因变异也易对抗病毒药物产生耐药性，且目前临床上使用的抗病毒药物大多存在不良反应。因此，开发新型抗感染药物仍是感染性疾病领域的重要研究课题。
3.1 细菌感染性疾病的治疗研发可替代抗生素的新型抗菌药物备受关注。相关研究显示，核酸适配体具有开发为抗菌药物的潜力。核酸适配体治疗细菌感染性疾病的机制主要有以下几方面。
3.1.1 靶向细菌生理过程的关键分子Baig等[19]筛选获取了靶向结合结核分枝杆菌中乙酰羟酸合成酶的核酸适配体。该核酸适配体可抑制乙酰羟酸合成酶的活性，进而实现抗结核分枝杆菌的作用。该研究中核酸适配体显示出极高的抑菌效果，在纳摩尔浓度级别即可抑制乙酰羟酸合成酶90%的活性，有望开发为新型抗结核药物。对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌主要是由于其能产生分解抗生素的β-内酰胺酶，因而治疗此类细菌引起的感染时，可将抗生素与β-内酰胺酶抑制剂联合应用。Kim等[20]获取了对蜡状芽孢杆菌β-内酰胺酶具有极高特异性的单链DNA适配体，这两种核酸适配体对β-内酰胺酶的抑制常数Ki分别为0.92和0.31 nmol/L，均在纳摩尔级别，可作为有效的β-内酰胺酶抑制剂。
3.1.2 调控机体对细菌的免疫反应Chen等[21]通过SELEX技术获取了抗结核分枝杆菌H37Rv的DNA适配体。该DNA适配体可促进CD4+ T细胞内γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)的分泌，并抑制结核分枝杆菌对CD8+ T细胞和吞噬细胞的侵袭，从而发挥抗菌作用。在小鼠模型中，对照组小鼠注射H37Rv后的半数死亡时间为13 d，而经注射核酸适配体治疗的实验组小鼠的半数死亡时间延长了3 d左右。组织病理学显示，与对照组相比，经核酸适配体治疗的小鼠肺组织病理变化明显减轻。Kristian等[22]的研究则提供了一种全新的抗菌治疗思路。与其他哺乳动物不同，人体细胞不表达α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-GAL)受体。但由于受肠道菌群带有的α-GAL刺激，人体体液中存在相应α-GAL抗体。Kristian等将靶向A群链球菌(group A Streptococcus，GAS)表面M蛋白的核酸适配体与GAL缀合，结果显示，在该核酸适配体与细菌结合后，与核酸适配体结合的GAL可介导吞噬细胞对GAS的吞噬杀伤作用，有利于清除细菌。
3.1.3 靶向细菌分泌的致病物质一些细菌入侵机体后，主要靠菌体分泌的毒素和酶等引起机体病理反应，清除这些致病物质也是治疗的重要部分。金黄色葡萄球菌可分泌多个不同血清型的超抗原肠毒素，极微量的肠毒素即可激活大量T细胞，诱导机体强烈的炎症反应，严重时可引发中毒性休克综合征(toxic shock syndrome，TSS)，因此阻断肠毒素的作用对金黄色葡萄球菌感染的治疗具有十分重要的意义。Wang等[23]通过SELEX技术获取了对葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)高亲和力的核酸适配体拮抗剂A11，可有效阻断SEB诱导的炎症反应。在小鼠模型中，注射SEB诱导小鼠发生TSS，36 h存活率为50%，而提前注射A11的小鼠36 h存活率高达90%。随后，该课题组又获取了针对葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)的核酸适配体拮抗剂S3，在注射SEA诱导小鼠发生TSS的模型中，对照组小鼠36 h存活率为26%，而治疗组小鼠于注射SEA 30 min后再注射S3，其36 h存活率达76%[24]。这些结果表明，核酸适配体可有效阻断肠毒素的致炎效应，控制TSS，在开发感染控制药物方面极具潜力。
3.2 病毒感染性疾病的治疗目前，通过核酸适配体治疗病毒(如HIV-1、肝炎病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒)感染性疾病等方面已有大量基础研究[25]。核酸适配体主要通过以下几种方式抑制病毒的复制过程或促进细胞的抗病毒作用：①与病毒的表面蛋白及其识别的细胞受体结合，阻断病毒对细胞的黏附过程，如靶向流感病毒包膜上血凝素的抗流感病毒核酸适配体[26]。②靶向病毒基因组表达过程的关键酶和蛋白质，抑制病毒的复制过程，如通过结合病毒甲基转移酶进而抑制登革热病毒的核酸适配体[27]。③将核酸适配体与治疗性分子如核酸酶、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)等结合，构成以核酸适配体为递送工具和以治疗性分子为治疗配基的靶向药物。在开发HIV-1治疗药物方面，靶向CD4和gp120的核酸适配体与siRNA的嵌合物显示出良好的应用潜力[28]。④通过调控细胞的抗病毒信号通路，促进免疫应答。维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)蛋白是细胞内识别病毒核酸的受体，主要被5 ′端有三磷酸修饰的RNA激活，可介导机体的抗病毒免疫反应。Hwang等[29]筛选出了一种RNA适配体，可特异性靶向激活RIG-Ⅰ，促进β干扰素(interferon β，IFN-β)的表达，发挥抗病毒作用。虽然目前尚未有抗病毒核酸适配体药物进入临床试验，但核酸适配体在抗病毒药物开发中的潜力值得关注和进一步研究。
4 结语核酸适配体在感染性疾病诊治领域中的应用潜力已得到广泛认可，在目前感染性疾病诊治形势仍然严峻的情况下，尤其值得关注。核酸适配体应用的发展也存在一些问题，如利用SELEX技术筛选针对靶分子的核酸适配体时，成功率较低，可投入实际运用的核酸适配体更是少之又少。另一方面，作为药物时，核酸较小的相对分子质量赋予了核酸适配体较好的组织穿透性和较低的免疫原性，但也使得核酸适配体在机体内易被肾脏过滤和核酸酶降解，往往需对其进行适当修饰，以延长半衰期，这也提高了核酸适配体应用的门槛。
为提高核酸适配体筛选的效率和成功率，已发展出一些改进型SELEX技术，但相关研究较困难，进展缓慢。研究热点转移至核酸适配体的应用后，研究上游SELEX技术发展的问题可能进一步凸显，成为制约核酸适配体应用的瓶颈，值得学界关注。核酸适配体修饰已有许多方式，如通过连接聚乙二醇基团，适当增加核酸适配体相对分子质量，以延长体内循环时间；用氟原子和甲氧基等取代核苷酸中的羟基，能增强核酸适配体对核酸酶的抵抗能力，提高其半衰期。但繁多的修饰方式并不利于降低成本和核酸适配体应用的发展，未来在核酸适配体修饰领域还是应寻求通用化的解决方案。总体来说，在感染性疾病诊断的初步应用中，核酸适配体在早期检测、成本及灵敏度等方面有优异表现。待相关技术成熟，核酸适配体极有可能颠覆当前医学诊断领域中以抗原抗体反应为主的检测体系。在疾病治疗方面，核酸适配体距临床应用尚有一段距离，不过基础研究已证明核酸适配体在抗病原体感染中的价值。相信随着SELEX技术、核酸适配体改造修饰方法等的进一步发展，未来核酸适配体极有可能像抗体一样在感染性疾病领域中发挥重要作用，成为下一代诊疗技术的载体。
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