2018, Vol. 13
奶牛乳腺炎是奶牛中常见的乳腺炎症反应，严重影响牛奶的质量和产量。其主要致病菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等[1]。金黄色葡萄球菌是隐性奶牛乳腺炎的主要致病菌[2]。目前，抗生素是治疗奶牛乳腺炎的主要手段[3]，但抗生素长期使用往往引起细菌耐药性，导致治疗效果不佳[4]，且牛奶因抗生素残留而被废弃，严重影响牛奶产业[5]。
噬菌体用于抗菌治疗具有特异性强、成本低等优点，且不会产生耐药性等不良反应，逐渐引起国内外研究者的重视[6]。已有一些研究成功利用金黄色葡萄球菌噬菌体进行了奶牛乳腺炎治疗[7-8]，为奶牛乳腺炎的噬菌体疗法提供了理论基础。
噬菌体具有宿主特异性，获得更多种类的噬菌体，建立噬菌体库，对更好地应用噬菌体疗法具有重要意义。本研究从奶牛场废水中分离到两株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体，对其生物学和基因组学特征进行了分析。
1 材料与方法 1.1 材料金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923、1株牛源金黄色葡萄球菌cowSA_1、1株人源金黄色葡萄球菌humanSA_1及1株人源表皮葡萄球菌(S. epidermidis)humanSE_1为本实验室保藏。细菌培养采用高盐LB培养基(酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠70 g/L，pH 7.0，分别添加0.7%琼脂糖和1.8%琼脂获得半固体和固体高盐LB培养基)。
1.2 方法 1.2.1 噬菌体的分离和纯化取自上海市宝山区某奶牛场，样品为患病奶牛乳房清洗液，4 ℃ 2 000 g离心10 min后取上清液，以ATCC 25923作为指示菌，用双层琼脂平板法检测是否含有裂解性噬菌体。挑取单个噬斑，进行反复噬斑纯化，直至获得形态和大小一致的噬斑。
1.2.2 噬菌体的电子显微镜观察采用磷钨酸负染法。取15 mL扩增纯化的噬菌体裂解液，超滤管浓缩为1 mL，取100 μL浓缩液滴于干净的铜网上，待其沉降10 min，用2%磷钨酸(pH 6.8)染色10 min，滤纸吸去残余液体，透射电子显微镜(型号：JEM-2100)观察噬菌体形态。
1.2.3 噬菌体的热稳定性噬菌体用无菌SM缓冲液(5.8 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、50 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5、5 mL 2%明胶、1 L H2O)稀释，以合适比例与ATCC 25923菌液混合，分别置于4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴孵育1 h后，测定噬菌体的滴度。
1.2.4 噬菌体的酸碱稳定性噬菌体用SM缓冲液适当稀释后，加至pH为1.0~10.0的TM缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.2~7.5、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2，加浓盐酸或5 mol/L NaOH调节成不同pH的缓冲液，加H2O定容至100 mL)，以及pH为11.0、12.0的NaH2PO4-NaOH缓冲液(50 mL 0.05 mol/L NaH2PO4、26.9 mL 0.1 mol/L NaOH，用5 mol/L NaOH调节成不同pH的缓冲液，加H2O定容至100 mL)中，37 ℃水浴孵育1 h后，测定噬菌体滴度。
1.2.5 噬菌体的一步生长曲线经测定，OD600=0.5时，菌液密度为2.26×108 CFU/mL，以此计算噬菌体感染的感染复数(multiplicity of infection，MOI)。培养ATCC 25923至对数生长期OD600=0.5，以MOI=0.01 PFU/CFU加入噬菌体液，37 ℃孵育10 min，13 000 g离心10 min，弃上清液，沉淀重悬于5 mL培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养。每隔10 min取样，分别测定噬菌体滴度。
1.2.6 噬菌体抑菌能力测定将对数生长期的ATCC 25923以MOI为0、0.01、0.1、1 PFU/CFU的比例加入噬菌体液，37 ℃ 200 r/min振荡培养，每隔30 min取出100 μL混合液测OD600值。
1.2.7 噬菌体基因组测序及分析噬菌体基因组抽提采用λ噬菌体DNA快速抽提试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)，按说明书操作；全基因组序列分析由美吉生物有限公司利用Illumina PE测序平台进行；全基因组序列功能注释采用RAST(http://rast.nmpdr.org/)在线软件[9-11]；用MAGE5构建系统进化树[12]。
2 结果 2.1 噬菌体的分离和电子显微镜观察以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为宿主菌，从奶牛场分离得到两株金黄色葡萄球菌烈性噬菌体。经过3次纯化后，在双层琼脂平板上形成清晰、透亮的噬斑，直径0.5~1.0 mm，分别命名为phiSA_BS1和phiSA_BS2。噬菌体经磷钨酸负染后，透射电子显微镜观察结果显示，两株噬菌体均由一个多面体对称的头部和可伸缩尾部组成(图 1)。phiSA_BS1头部长(86.1±3.9) nm，宽(74.7±3.9) nm；尾长(214.1±16.5) nm，宽(21.9±5.5) nm。phiSA_BS2头部长(85.9±5.3) nm，宽(74.0±7.3) nm；尾长(222.2±8.6) nm，宽(18.2±1.9) nm。从形态上初步判断两株噬菌体均属于肌尾噬菌体科[13]。
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| A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2. 图 1 两株金黄色葡萄球菌噬菌体的电子显微镜观察 Fig. 1 Electron microscopy of two isolates of Staphylococcus aureus phages |
将噬菌体与金黄色葡萄球菌ATCC 25923以MOI=0.01混合，振荡培养，每隔10 min取样并测定噬菌体滴度。结果如图 2A所示，phiSA_BS1的潜伏期约为20 min，裂解期约为20 min，溶菌周期为20~40 min，裂解量约为127 PFU/cell。phiSA_BS2的潜伏期约为20 min，裂解期比phiSA_BS1略长，约为30 min，溶菌周期为20~50 min，裂解量约为139 PFU/cell。
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| A: One-step growth curve. B: pH tolerance. C. Temperature tolerance. 图 2 两株噬菌体的生物学性状 Fig. 2 Biological properties of phiSA_BS1 and phiSA_BS2 |
将phiSA_BS1、phiSA_BS2适当稀释后加至不同pH的缓冲液中，37 ℃水浴孵育1 h后测定滴度。结果如图 2B所示，phiSA_BS1的pH耐受范围为5.0~10.0，phiSA_BS2的pH耐受范围为3.0~10.0。当pH＞11或pH＜2时，两株噬菌体几乎全部失活。总体来看，两株噬菌体具有较宽的酸碱耐受性，phiSA_BS2的耐酸性更强。
2.2.3 热稳定性将噬菌体分别在不同温度下孵育1 h后，测定滴度。结果如图 2C所示，50 ℃仍保留相当高的滴度，但＞60 ℃时两株噬菌体几乎全部失活。
2.2.4 抑菌能力将对数期ATCC 25923以不同MOI加入噬菌体液，振荡培养，每隔30~60 min取100 μL混合液测OD600值。结果如图 3所示，相比于对照组，两株噬菌体均有效抑制了宿主菌的增殖。phiSA_BS1在MOI=1、0.1、0.01时能有效抑制宿主菌增殖。phiSA_BS2在MOI=1和0.1时也可有效抑制宿主菌增殖，但所需时间更长，裂解效率略低于phiSA_BS1。
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| A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2. 图 3 两株噬菌体的抑菌能力 Fig. 3 Inhibition of S. aureus by phiSA_BS1 and phiSA_BS2 |
取等量phiSA_BS1与phiSA_BS2，分别感染一定数量的ATCC 25923，牛源和人源金黄色葡萄球菌分离株cowSA_1、humanSA_1，表皮葡萄球菌分离株humanSE_1，37 ℃培养24 h，观察噬菌斑的数量及大小。结果如表 1所示，两株噬菌体对3株金黄色葡萄球菌均有裂解作用，但对表皮葡萄球菌没有裂解作用。比较噬菌斑数量和大小，以ATCC 25923最多，噬菌斑也最大，为0.5~1 mm；其次为cowSA_1，噬菌斑大小为0.3~0.5 mm；humanSA_1的噬菌斑最小，为0.2~0.3 mm。两株噬菌体对这3株金黄色葡萄球菌的裂解能力大小为：ATCC 25923>cowSA_1>humanSA_1。
| Phage | ATCC 25923 | cowSA_1 | humanSA_1 | humanSE_1 | ||
| phiSA_BS1 | Titer (×108 PFU/mL) | 10.0±4.8 | 8.35±0.37 | 3.25±0.02 | 0 | |
| Size of plaques | +++ | ++ | + | - | ||
| phiSA_BS2 | Titer (×108 PFU/mL) | 2.96±0.05 | 4.16±0.15 | 1.26±0.06 | 0 | |
| Size of plaques | +++ | ++ | + | - | ||
| +++: large size plaques; ++: median size plaques; +: small size plaques; -: no plaques. | ||||||
采用二代测序技术完成两株噬菌体的测序。基因组核酸序列及注释结果已提交GenBank数据库(登录号MH078572、MH028956)。序列特征如表 2所示，两者基因组大小分别为142.9 kb和149.2 kb。与phiSA_BS1相比，phiSA_BS2基因组全长多出7 kb左右，GC含量略低于前者，多出9个开放读码框(open reading frame，ORF)。
| Genome | phiSA_BS1 | phiSA_BS2 |
| Type of nucleic acid | Linear, double-stranded DNA | Linear, double-stranded DNA |
| Length | 142 978 bp | 149 230 bp |
| GC content | 29.80% | 29.61% |
| Predicted ORFs | 201 | 210 |
| Structure and proteins | 8 | 4 |
| Porin | 1 | 1 |
| Lysin | 1 | 2 |
| Hypothetic proteins | 164 | 169 |
| DNA replication and modification | 24 | 20 |
| Transcription regulation | 2 | 1 |
| tRNA | 0 | 1 |
| Other | 1 | 12 |
将phiSA_BS1、phiSA_BS2的全基因组核酸序列及主要尾部蛋白(major tail protein)、噬菌体裂解酶(endolysin)等蛋白序列与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库比对，应用MEGA软件进行进化树分析，结果如图 4~6所示。
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| 图 4 噬菌体全基因组核酸序列进化树分析 Fig. 4 Phylogenic analysis of full genome of phages |
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| 图 5 噬菌体主要尾部蛋白的进化树分析 Fig. 5 Phylogenic analysis of major tail proteins of phages |
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| 图 6 噬菌体裂解酶进化树分析 Fig. 6 Phylogenic analysis of lysins of phages |
全基因组分析结果表明，phiSA_BS1与phiSA_BS2的同源性高达99%，但两者与已报道的金黄色葡萄球菌噬菌体亲缘关系较远(图 4)，判断两株噬菌体构成金黄色葡萄球菌噬菌体的新进化分支。对主要尾部蛋白的分析也证实了这一点(图 5)。
3 讨论本研究分离到两株金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体phiSA_BS1和phiSA_BS2，并对形态、复制特征、热稳定性、pH稳定性及其对不同葡萄球菌分离株的裂解性进行了初步研究。结果表明，这两株噬菌体能耐受50 ℃处理，pH耐受范围也较宽。考虑到生物安全性，对这两株噬菌体在乳酸菌、肠杆菌、肠球菌中进行了裂解实验，结果均为阴性(数据未在本文显示)。
对两株噬菌体进行全基因组测序，结果表明，两株噬菌体的亲缘关系非常接近，同源性高达99%，但均与已知的金黄色葡萄球菌噬菌体亲缘关系较远。与最近缘的噬菌体676Z进行NCBI blastn全基因组比较，发现phiSA_BS1与其覆盖度(query cover)为42%，相似度(ident)为75%；phiSA_BS2与其覆盖度为41%，相似度为75%。由此可判断两株噬菌体均为全新的金黄色葡萄球菌噬菌体进化分支。对噬菌体功能基因的系统发育分析也证实了这一点。
噬菌体裂解酶因具有直接的杀菌作用而受到关注。将两株噬菌体的裂解酶氨基酸序列与NCBI数据库进行比对分析发现，同源性较高的序列均为金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、小牛葡萄球菌(S. vitulinus)等中含CHAP结构域的蛋白(CHAP domain-containing protein)，与其他噬菌体的裂解酶显著不同，具有一定的研究价值。
奶牛乳腺炎是乳业的重要挑战之一。一方面细菌耐药性的日益增长使其治疗越来越困难，另一方面即使可用抗生素进行治疗，但用药后相当长时间内所产的牛奶会因为抗生素污染而被废弃。因此，研发替代抗生素的疗法很有意义，噬菌体疗法就是潜在的替代疗法之一。体外实验中，已有相关研究证实金黄色葡萄球菌噬菌体可有效抑制宿主菌增殖[14-16]。体内实验中，奶牛乳腺炎的噬菌体疗法也取得了一定进展。例如，孙利利等[8]将噬菌体通过乳头管灌注患病乳室，对急性乳腺炎奶牛进行治疗，发现噬菌体具有明显疗效。近年来，对致病性金黄色葡萄球菌噬菌体的分离越来越多，生物学性状也获得了鉴定。随着高通量测序的发展，噬菌体全基因组序列特征得到了解析，完善了噬菌体库，为奶牛乳腺炎的噬菌体疗法提供了基础数据[17-21]。本研究从奶牛场分离到的两株噬菌体均为裂解性噬菌体，生物学性状稳定，在奶牛乳腺炎的治疗中具有潜在应用价值。
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