2019, Vol. 14
2. 复旦大学附属华山医院抗生素研究所，上海 200040;
3. 南通大学附属南通第三医院检验科，江苏 南通 226000
2. Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China;
3. Department of Clinical Laboratory, The Third Hospital Affiliated to Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Province, China
金黄色葡萄球菌是医院和社区感染的重要病原体之一，可引起坏死性肺炎、中毒性休克综合征、化脓性感染等疾病，这与其分泌的多种毒素因子密切相关[1-3]，其中双组分成孔杀白细胞素(leukocidin)发挥着重要作用。金黄色葡萄球菌能分泌6种双组分杀白细胞素：Panton-Valentine杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL；也称LukSF-PV)、杀白细胞素ED(leukocidin ED，LukED)、γ溶血素(包括HlgAB和HlgCB)、杀白细胞素AB(leukocidin AB，LukAB；也称LukGH)及杀白细胞素MF'(leukocidin MF'，LukMF')[2, 4-5]。这些毒素均由两个独立的水溶性亚基S和F组成。细菌感染过程中，S亚基首先识别宿主细胞膜，随后募集F亚基形成横跨细胞膜的β桶状孔，从而引起宿主细胞膜破裂, 导致细胞死亡[6-8]。
一直以来，PVL是金黄色葡萄球菌毒力的研究热点[9]。近几年来，LukED在金黄色葡萄球菌致病机制中的重要作用得到越来越多实验的证实。研究表明，LukED可与巨噬细胞、T细胞和树突细胞表面的趋化因子受体CCR5，中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞表面的CXCR1/2受体及红细胞表面的DARC受体结合，引起相应靶细胞裂解，促进感染发生[10-13]。LukED皮内注射兔子可引起明显的局部炎症和皮肤坏死反应，毒性程度与PVL引起的皮肤坏死相当[14]。小鼠血流感染模型中，金黄色葡萄球菌lukED缺失突变株(ΔlukED)感染小鼠的生存率明显高于野生型菌株，其肝、肾等器官中细菌复制能力降低，白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)减少[15]。流行病学资料显示，LukED与金黄色葡萄球菌所致脓疱病、抗生素相关性腹泻密切相关，且在临床金黄色葡萄球菌中呈现较高的流行率[4-5, 16]。
LukED表达受培养基、生长阶段等多种因素的影响。Gravet等[14]研究显示，LukED在脑浸液培养基中检测不到，而在酵母提取物-酪蛋白氨基酸-丙酮酸钠(yeast extract-casamino acids-sodium pyruvate，YCP)培养基中可检测到。Bronner等[17]采用半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，SqRT-PCR)检测YCP及其他培养基中各毒素表达情况，但准确率欠佳，且缺乏深入研究。因此，本实验拟研究5种常用培养基及细菌生长阶段对lukED转录的影响，探讨培养基组分对lukED转录的影响，为后续LukED研究获得足量毒素奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株金黄色葡萄球菌Newman菌株由复旦大学附属华山医院抗生素研究所保存及惠赠。
1.1.2 培养基脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth，BHI)、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB)、溶菌肉汤(lysogeny broth, LB)及Mueller-Hinton肉汤(Mueller-Hinton broth，MHB)购自英国Oxoid公司。YCP [30 g/L酵母提取物、20 g/L酪蛋白氨基酸、20 g/L丙酮酸钠、2.5 g/L Na2HPO4、0.42 g/L KH2PO4，pH 7.0]为本实验室自行配制，其中酵母提取物购自Oxoid公司，酪蛋白氨基酸购自美国Amreso公司，丙酮酸钠、Na2HPO4和KH2PO4购自生工生物工程(上海)股份有限公司。向LB培养基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化钠)中分别加入YCP培养基各成分(终浓度与YCP一致)，配制新的培养基并分别命名为LBY(LB+25 g/L酵母提取物)、LBC(LB+20 g/L酪蛋白氨基酸+2.5 g/L Na2HPO4+0.42 g/L KH2PO4；实验过程中发现，只向LB中添加酪蛋白氨基酸难以溶解，因此将无机盐一并加入助其溶解)、LBP(LB+20 g/L丙酮酸钠)。
1.1.3 主要试剂及仪器荧光定量PCR仪及NanoDrop2000超微量分光光度计为赛默飞世尔科技有限公司产品，PCR 8连管及96孔板为Axygen公司产品，紫外分光光度计为尤尼柯公司产品，蛋白酶K、RNA抽提试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser及荧光定量试剂盒TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司，引物合成及溶葡萄球菌酶由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，金黄色葡萄球菌裂解液由本实验室自行配制(专利号ZL201310124795.2)。
1.2 方法 1.2.1 生长曲线测定挑取新鲜Newman菌株的单个菌落至3 mL TSB中，37 ℃，150 r/min培养过夜。随后吸取300 μL菌液至30 mL新鲜培养基中(1: 100稀释)，37 ℃，150 r/min培养，每隔1 h取样测定OD600值，监测细菌生长情况。
1.2.2 qRT-PCR检测lukE基因表达收集TSB、BHI、YCP、MHB和LB五种培养基中对数生长早期(TSB、BHI、YCP和MHB为3 h，LB为5 h)、中期(TSB、BHI和YCP为4 h，MHB为5 h，LB为7 h)、晚期(TSB、BHI和YCP为5 h，MHB为7 h，LB为9 h)及平台期(TSB、BHI和YCP为7 h，MHB为9 h，LB为11 h)菌液，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，用含100 μL裂解液、10 μL蛋白酶K和10 μL溶葡萄球菌酶的溶液重悬菌体，56 ℃裂解1 h。用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取细菌RNA，去除基因组DNA后，反转录为cDNA。以16S rRNA为内参基因，qRT-PCR测定lukE基因mRNA表达(TB Green Premix Ex Taq)(LukED由共转录于一条mRNA的lukE和lukD两个基因编码，因此检测lukE基因可反映lukED的表达)。引物序列见表 1[18-19]。
| Gene | Sequence (5'-3') | Reference |
| lukE | F GAAATGGGGCGTTACTCAAA | 18 |
| R GAATGGCCAAATCATTCGTT | 18 | |
| 16S rRNA | F CGTGCTACAATGGACAATACAAA | 19 |
| R ATCTACGATTACTAGCGATTCCA | 19 |
为研究YCP培养基成分对lukE基因表达的影响，分别检测Newman菌株于LBY、LBC和LBP培养基5 h培养物中lukE mRNA，以LB和YCP培养基同一时间的培养物为对照。
1.3 统计学分析用SAS软件进行统计学分析，两样本比较采用t检验，两个以上样本的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 生长曲线Newman菌株在TSB、BHI、YCP、MHB和LB培养基中的生长曲线(图 1A)显示，其在BHI、TSB和YCP培养基中生长速度较快，2~3 h后进入对数生长期，7~9 h后进入平台期；在MHB和LB培养基中生长较慢，3~4 h后进入对数生长期，12 h后进入平台期。
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| 图 1 金黄色葡萄球菌Newman菌株在不同培养基中的生长曲线 Fig. 1 The growth curves of S. aurues Newman strains cultured in different media |
Newman菌株在LB、LBY、LBC及LBP培养基中的生长曲线(图 1B)显示，添加酪蛋白氨基酸的LBC培养基中细菌生长速度最快，6~8 h进入平台期；添加酵母浸出物(LBY)或丙酮酸钠(LBP)的培养基中细菌生长较LB稍好。
2.2 生长阶段对lukE表达的影响根据图 1A中的生长曲线，挑选TSB、BHI、YCP、MHB、LB培养基中对数生长早期、中期、晚期及平台期细菌进行研究。在TSB、BHI和YCP培养基中，从对数生长早期到晚期，lukE基因表达显著增加，并在对数生长晚期达到最高水平(图 2A、2B、2C)。相对于对数生长早期，对数中、晚期变化倍数分别为TSB：4.48和7.82；BHI：4.90和6.90；YCP：3.97和7.71(P＜0.05)。随后进入平台期，lukE基因转录水平显著下降，与对数生长早期水平相当(P＞0.05)。在MHB培养基中，对数生长早、中、晚期lukE基因表达无显著差异，而平台期显著增加(为对数早期的3.85倍)(P＜0.05)(图 2D)。在LB培养基中，lukE基因表达在整个生长周期中虽有增加趋势，但差异没有统计学意义(P＞0.05)(图 2E)。
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| The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed with t-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest. *P < 0.05. A: Tryptic soy broth (TSB). B: Brain heart infusion broth (BHI). C: Yeast extract-casamino acids-pyruvate (YCP). D: Mueller Hinton broth (MHB). E: Lysogeny broth (LB). EE, early-exponential phase; ME, middle-exponential phase; LE, late-exponential phase; ST, stationary phase. 图 2 lukE基因在金黄色葡萄球菌Newman菌株不同生长阶段的相对表达 Fig. 2 Relative transcription levels of lukE in S. aureus Newman strains at different growth phases |
表 2比较了各培养基中lukE表达的差异。可看出，YCP培养基中lukE mRNA水平在各生长时期均显著高于TSB和BHI培养基中对应时期：在对数生长早期，YCP培养基中lukE表达量是TSB的4.73倍，是BHI的3.85倍；在对数生长中期，YCP培养基中lukE表达量是TSB的4.19倍，是BHI的3.11倍；在对数生长晚期，YCP培养基中lukE表达量是TSB的4.66倍，是BHI的4.28倍；在平台期，YCP培养基中lukE表达量是TSB的10.03倍，是BHI的4.80倍(P＜0.05)。比较TSB与BHI培养基，发现对数中期和平台期中lukE表达水平在BHI培养基高于TSB培养基(P＜0.05)，对数早期和对数晚期无显著差异(P＞0.05)。LB培养基中lukE基因表达水平较低：lukE在LB培养基中的表达量在对数生长早期是TSB的0.50倍(P＞0.05)，在对数生长中期是TSB的0.17倍(P＜0.05)，在对数生长晚期是TSB的0.13倍(P＜0.05)，而在平台期是TSB的1.68倍(P＜0.05)。MHB培养基中lukE表达最低：lukE在MHB培养基中的表达量在对数生长早期是TSB的0.25倍(P＜0.05)，在对数生长中期是TSB的0.11倍(P＜0.05)，在对数生长晚期是TSB的0.05倍(P＜0.05)，而在平台期与TSB无显著差异(P＞0.05)。
| Media | Growth phase | |||
| Early-exponential | Middle-exponential | Late-exponential | Stationary | |
| TSB | 1±0.24 | 4.48±0.27 | 7.82±0.36 | 0.80±0.11 |
| BHI | 1.23±0.26 | 6.03±0.40* | 8.51±0.99 | 1.67±0.23* |
| YCP | 4.73±0.83* | 18.76±1.33* | 36.41±2.84* | 8.02±1.22* |
| MHB | 0.25±0.04* | 0.48±0.05* | 0.36±0.06* | 0.96±0.05 |
| LB | 0.50±0.14 | 0.77±0.07* | 0.98±0.04* | 1.34±0.06* |
| The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed with t-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest. *P＜0.05 compared with TSB medium in the same growth phase. | ||||
上述结果表明，YCP培养基最适合lukE表达。本研究进一步探讨了YCP培养基中何种成分促进lukE基因表达水平。图 3显示，LBY、LBC、LBP培养基中lukE表达水平分别是LB的4.98、6.46和3.15倍(P＜0.05)，表明加入LB培养基中的酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸钠均可促进lukE基因表达。统计学分析显示，LBY与LBC培养基之间lukE表达无显著差异(P＞0.05)，但均显著高于LBP培养基(P＜0.05)。
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| The data are presented as mean±SD (3 independent experiments). Statistical analyses were performed with t-test and one-way analysis of variance followed by Bonferroni posttest. *P < 0.05 compared with LB group, #P < 0.05 compared with LBP group. 图 3 YCP培养基主要成分对金黄色葡萄球菌Newman菌株lukE基因表达的影响 Fig. 3 The effects of main compositions of YCP medium on transcription levels of lukE in S. aureus Newman strains |
金黄色葡萄球菌LukED毒素于1998年由Gravet等发现[14]，随后发现其在金黄色葡萄球菌致病机制中发挥重要作用[4-5, 20]，并可能成为金黄色葡萄球菌感染抗毒素治疗的潜在新靶点。因此，如何在体外获得大量LukED，对其研究非常必要。
本研究显示，在细菌不同生长阶段lukE基因的表达有较大差异，推测可能与细菌群体感应系统有关。金黄色葡萄球菌具有多种调控系统，包括双组分信号调节系统(如Agr)和转录因子(如Rot)等。Agr系统通过群体感应机制进行调控[21]，细胞生长起始时密度低，细菌产生的自诱导肽(autoinducing peptide，AIP)浓度也低，Agr系统低表达。细胞生长至一定密度时，AIP达到阈值浓度，Agr系统表达增加，效应分子RNAⅢ表达增加，促进毒素表达。研究表明，Agr通路能有效调节LukED毒素的产生[15]。Alonzo等[15]分别用金黄色葡萄球菌Newman野生株、agr敲除株(Δagr)感染小鼠，发现Δagr菌株LukED表达量大大降低，毒力明显减弱，小鼠耐受而不发生感染。因此推测，细菌生长阶段对lukE表达的影响可能部分是通过群体感应系统实现的。Newman菌株在对数生长早期时Agr系统低表达，lukE表达也保持在低水平；至对数中、晚期，细菌产生的AIP增多，Agr系统表达增加，lukE表达增加；而在平台期lukE表达骤减，可能与核糖核酸酶水平升高、细菌营养不足及mRNA不稳定等因素相关[22]。
本研究结果显示，培养基组成对Newman菌株lukE的表达有重要影响。在TSB、BHI、YCP、MHB和LB五种培养基中，YCP最有利于lukE表达，TSB和BHI中lukE表达尚可，而MHB和LB中lukE表达非常低。YCP培养基主要由酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸钠构成。酵母浸出物是一种以面包酵母、啤酒酵母或葡萄酒酵母为原料，通过自溶、酶解等工艺制成的富含蛋白质、多肽、氨基酸、维生素及微量元素的产品，是微生物培养的优质氮源[23]。提高酵母浸出物的浓度能增加细菌营养，促进细菌生长，从而促进毒力基因表达。这可能是LB培养基中虽然含有酵母提取物，但浓度较低，致使lukE表达较低的原因。酪蛋白氨基酸富含氨基酸，常用于配制培养基，用于金黄色葡萄球菌培养。丙酮酸钠是重要的中间代谢物，具有抗氧化性，在异养细菌培养中可替代葡萄糖作为碳源[24]。研究表明，丙酮酸钠可有效消除过氧化氢对细菌的损伤作用[25]，添加了0.3%丙酮酸钠的TSB培养基可使非可培养状态(viable but non-culturable，VBNC)的金黄色葡萄球菌恢复生长[26]。本研究显示，向LB中分别添加酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和丙酮酸钠均能促进lukE基因表达，但前两者的促进效果明显强于后者。
类似地，CCY培养基一直被认为是产生PVL的最佳培养基[27]，其组分包括30 g/L酵母浸出物、20 g/L酪蛋白氨基酸、23 g/L丙酮酸钠、6.3 g/L Na2HPO4、0.41 g/L KH2PO4，pH 6.7[27]。比较CCY与YCP配方，发现两者很相似，只有丙酮酸钠及Na2HPO4的含量有区别，KH2PO4的含量轻微不同。推测营养丰富的培养基更有利于杀白细胞毒素的表达。
总之，本研究表明对数生长后期是lukED表达的最佳时期，相较于TSB、BHI、LB和MHB培养基，YCP培养基最适合lukED mRNA表达，其中酵母浸出物和酪蛋白氨基酸是促进lukED mRNA表达的主要成分。
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