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  微生物与感染  2019, Vol. 14 Issue (3): 153-162      DOI: 10.3969/j.issn.1673-6184.2019.03.004
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Contents            PDF            Abstract             Full text             Fig/Tab
作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究
郭雅萌 1 , 侯琳琳 1 , 沈旦枫 1 , 邹琳 1 , 王蕾 1 , 李天胜 1 , 孙桂芹 2 , 陈力 1     
1. 复旦大学上海医学院基础医学院教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室,上海 200032;
2. 浙江中医药大学医学技术学院,杭州 310053
摘要:对脑膜炎败血伊丽莎白金菌进行糖苷酶功能基因组分析发现,该菌存在一个GH27家族α-半乳糖苷酶基因。克隆该基因并表达蛋白后,利用人工合成的pNP底物研究其酶学性质,发现该酶具有α连接的半乳糖(α-galactose, α-Gal)底物特异性,酶反应pH为3.0~8.0,反应温度为4~45 ℃。用不同寡糖底物进一步确定,该酶能够酶切直链末端α-1, 3、1, 4、1, 6Gal。在猪红细胞上进行的酶切实验显示,该酶能够高效清除存在于猪红细胞表面的末端Galα1-3Gal表位。末端α-半乳糖基化修饰在免疫与感染中发挥着重要的生物学作用,作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶的发现将为该领域的研究提供一个新的工具,为缓解异种输血中的超急性免疫排斥反应提供一种可能。
关键词α-半乳糖苷酶    酶学性质    Galα1-3Gal    脑膜炎败血伊丽莎白金菌    感染    
Identification and analysis of an alpha galactosidase(EmGalase) acting on species-differentiated epitopes
GUO Yameng 1 , HOU Linlin 1 , SHEN Danfeng 1 , ZOU Lin 1 , WANG Lei 1 , LI Tiansheng 1 , SUN Guiqin 2 , CHEN Li 1     
1. Key Laboratory of Medical Molecular Virology (MOE/NHC/CAMS), School of Basic Medical Sciences, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China;
2. College of Medical Technology, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053
Abstract: Through a functional genomic analysis for glycosidase, we identified a candidate alpha galactosidase in the genome of Elizabethkingia meningoseptica. The gene was cloned and expressed in Escherichia coli (E.coli). The purified protein was subjected to assays with synthetic p-nitrophenol (pNP) substrates for its enzymatic properties. The results indicated that it had alpha-linked galactose (α-Gal) substrate specificity. The optimum pH was between 3.0 and 8.0, and the optimum temperature was between 4 and 45 ℃. Further assays with oligosaccharide substrates and Mass Spectrometry analysis found that this enzyme could digest the terminal α-1, 3/1, 4/1, 6Gal, respectively. In addition, we also demonstrated that the enzyme can efficiently remove the terminal Galα1-3Gal antigen presented on porcine erythrocytes to alleviate hyperacute immune rejection in heterologous blood transfusion. As terminal alpha galactose modification plays an important biological role in immunity and infection, the reported alpha galactosidase may serve as a new tool for research in this field.
Keywords: Alpha galactosidase    Enzymatic properties    Galα1-3Gal    Elizabethkingia meningoseptica    Infection    

异种输血可以有效缓解人源血紧张的现状,是生物医学工程研究追求的方向。研究发现,人体IgG中有1%为抗异种(猪、鼠等)Galα1-3Gal表位的抗体,该抗体仅在人、猿和旧世界猴中发现[1]。由于异种表位的存在,人在接受异种来源血液时,会产生独特的抗Galα1-3Gal反应,这是导致人异种输血超急性免疫排斥反应的主因。针对这一技术难题,目前的解决办法有两种:一是利用基因敲除技术获得缺失Galα1-3Gal表位的工程猪[2-3],二是用α-半乳糖苷酶清除成熟猪红细胞表面的Galα1-3Gal,以缓解抗原抗体反应[4]

α-半乳糖苷酶是一种常见糖苷水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物中,能够水解糖脂和糖蛋白α连接的半乳糖残基,可用于制备Galα1-3Gal阴性猪红细胞。在碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database, CAZy)中[5],α-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶类(glycoside hydrolases, GHs)。目前已知的α-半乳糖苷酶主要分布于GH4、27、36、57、97和110家族。不同家族α-半乳糖苷酶在酶学性质等方面存在差异[6]。虽然α-半乳糖苷酶在医疗、食品与饲料等行业中已有较为广泛的应用,但是目前已见报道的能够修饰猪红细胞表面异种抗原的α-半乳糖苷酶主要有两个:一个来自咖啡豆,属于GH27家族[7];另一个来自脆弱类杆菌,属于GH110家族[4]。来自细菌GH27家族能够修饰猪红细胞表面异种抗原Galα1-3Gal的α-半乳糖苷酶目前未见报道。

脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingia meningoseptica,Em)是一种广泛分布于自然界中的革兰阴性菌,可能引起新生儿早产和不发达国家重症监护病房内新生儿脑膜炎[8],以及免疫缺陷成人院内感染(肺炎、心内膜炎、脑膜炎及术后菌血症)[9-10]。2015年末美国威斯康星州暴发了该菌的感染[11]。2011年本实验室从一位收治于重症监护病房的T细胞非霍奇金淋巴瘤的15岁病人中分离到一株Em,命名为FMS-007。对其完成了完整基因组测序,建立了Em的国际标准基因组序列,该序列可作为Em基因组研究的理想模板[12]。在此基础上,我们对Em展开糖苷酶功能基因组系统分析[13],已发现并报道了糖苷酶有PNGase F-Ⅱ[14]、cFase Ⅰ[15]、cXase Ⅰ等。

本研究的主要内容是对FMS-007中作用于种属差异性表位的α-半乳糖苷酶进行基因克隆、表达和分析。研究发现,该酶属于GH27家族,可用于制备Galα1-3Gal阴性的猪红细胞,为应急状况下的异种输血提供一种可能的工具。该酶被命名为EmGalase。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和细胞

FMS-007由本实验室保存,猪红细胞由中国农业科学院上海兽医研究所提供。

1.1.2 仪器和试剂

PrimeSTAR® Max DNA Polymerase和DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司;isoglobotriose和globoside Gb4购自青岛曙格生物技术有限公司,Pk antigen购自ELICITYLC公司,显色pNP底物购置于英国Carbosynth公司,isolectin B4 (BSI-B4-FITC)购自Sigma-Aldrich公司,1000 Touch梯度PCR仪和Sub-Cell GT水平电泳槽、Mini PROTEAN Tetra垂直电泳槽为美国Bio-Rad公司产品,光学显微镜ECLIPSE为尼康显微公司产品,Legend Micro 17微量台式离心机和NanoDrop 2000微量分光光度计购自Thermo公司。

1.2 方法 1.2.1 EmGalase基因的克隆、表达和纯化

模板基因组来源于实验室前期工作,即对FMS-007的完整基因组测序,得到一个总大小为3 938 967 bp的完整图谱。在CAZy数据库的基础上,通过糖苷酶功能基因组学分析发现FMS-007中存在一个GH27家族的α-半乳糖苷酶。以卡那霉素(kanamycin,Kana)抗性的pET28a(+)为载体,选择NdeⅠ和XhoⅠ两个酶切位点,设计上游引物5′-TCCATATGATGTTGTTTTCTCAAAAAGC-CAAAC-3′,下游引物5′-CGCTCGAGCTAAT-AAGTCTTCAGAACAATGATA-3′,6×His标签位于蛋白C端,重组质粒命名为pET28a-EmGalase,由金唯智公司对克隆基因进行序列分析。

将测序正确的重组质粒pET28a-EmGalase转化入表达载体——大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3),得到BL21(DE3)-pET28a-EmGalase表达菌,28 ℃ 160 rpm小量诱导14 h,将诱导后的细胞破碎,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测上清液中的蛋白,目的蛋白相对分子质量为41 600。

将表达菌转接至1 L LB培养基,37 ℃ 200 rpm培养至OD600 0.6~0.8,用1 mL 1 mol异丙基硫代半乳糖苷大量诱导表达。以7 500 rpm转速离心5 min后收获细胞,重悬于60 mL 10 mM的咪唑中。将悬浮的大肠埃希菌细胞高压破碎处理,在4 ℃条件下以12 000 rpm转速离心25 min,收集上清液中的细胞提取物,将上清液与提前准备好的镍柱在4 ℃条件下充分结合2 h后以400 rpm转速离心2 min。将填料加至空柱中,期间用25 mmol咪唑冲洗2~3次,用1 mL不同浓度(50 mmol、100 mmol、200 mmol、500 mmol)咪唑缓冲液洗脱,并分别收集洗脱液。利用SDS-PAGE选择拥有较纯净目的蛋白的洗脱液,用pH7.4 PBS作为透析液进行透析。每隔6 h换1次透析液,一共4次,收集透析袋中的液体。使用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2 EmGalase的底物特异性以及酶学性质

利用人工合成的14种pNP底物探究EmGalase的α-半乳糖苷酶活性及底物特异性,底物包括pNP-α-D-Gal、pNP-β-D-Lac、pNP-Xylosel、pNP-N-acetyl-α-D-Glc、pNP-β-D-Fuc、pNP-N-acetyl-β-D-Glc、pNP-N-acetyl-β-D-Gal、pNP-α-D-Glc、pNP-α-D-Man、pNP-β-D-Man、pNP-β-D-Gal、pNP-β-L-Fuc、pNP-β-D-Glc、pNP-N-acetyl-α-D-Gal,每种底物的浓度均为10 mmol。反应在96孔板中进行,对照组分别加入5 μL底物和45 μL PBS,实验组分别加入5 μL底物、43 μL PBS和2 μL EmGalase。在37 ℃反应30 min后,分别加入75 μL 1 mol的Na2CO3终止反应,测量OD405用于判断EmGalase与不同底物的反应能力。

表 1制作EmGalase标准曲线,每个体系为60 μL,在pH 7.4 PBS中进行。在37 ℃反应30 min,用75 μL 1 mol的Na2CO3终止反应,酶标仪测量OD405并制作关于OD405和pNP浓度的回归直线。EmGalase的最适pH值实验:每孔加入53 μL pH 7.4 PBS、5 μL 10 mmol的pNP-Gal、2 μL EmGalase,用HCl和NaOH调节pH分别至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,在37 ℃反应30 min,用75 μL 1 mol Na2CO3终止反应,测量OD405用于判断EmGalase在不同pH值条件下的反应能力。

表 1 pNP浓度梯度 Tab. 1 Different gradient concentrations of pNP
A B C D E F G H
Concentrations of pNP(mmol) 0 0.015 625 0.031 25 0.062 5 0.125 0.25 0.5 1

EmGalase的最适温度实验:每孔加入54 μL pH 7.4 PBS、5 μL 10 mmol pNP-Gal、1 μL EmGalase,分别置不同温度条件下(4、20、30、37、45、55、65、75、85 ℃)反应15 min,用75 μL 1 mol Na2CO3终止反应,测量OD405用于判断EmGalase在不同温度条件下的反应能力。

不同金属离子及化合物对EmGalase的影响:选取96孔板中10个孔,每孔加入1 μL EmGalase、5 μL pNP-Gal、43.5 μL pH6.8 CH3COONH4,1~10孔分别加入0.5 μL浓度为1 mol的Zn2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+及化合物EDTA、SDS,使不同离子或化合物在每孔50 μL反应体系中的终浓度为10 mmol。在37 ℃反应30 min,用75 μL 1 mol的Na2CO3终止反应,测量OD405用于判断EmGalase在金属离子及试剂影响下的反应能力。

EmGalase米氏常数曲线:每孔添加49 μL用PBS稀释的不同浓度(0、0.2、0.4、0.8、1、2、3、4 mmol)的pNP-α-Gal及1 μL 0.25 mg/mL的EmGalase,在37 ℃反应15 min,用75 μL 1 mol Na2CO3终止反应,测量OD405用于判断EmGalase释放Gal的能力大小。

EmGalase酶切不同寡糖底物的质谱检测:取10 mmol寡糖底物各1 μL,分别加入1 μL 0.25 mg/mL的EmGalase及9 μL pH4 CH3COOH,37 ℃反应3 h。每个反应产物加200 μL去离子水稀释后,用LTQ Orbitrap XL高分辨串联多级质谱进行检测。

EmGalase酶切不同寡糖底物的D-Galactose kit检测:按照试剂盒的要求准备样品,即每个体系含有2 μL EmGalase,3.11 μL 10 mmol寡糖底物和8.89 μL pH7.4 PBS,37 ℃反应2 h。

按照表 2配制检测体系,加样于96孔板,轻混匀。30 ℃作用3 min后,检测OD340,记为A1。之后每孔加入2 μL β-GalDH/GalM后,轻混匀,30 ℃放置6 min后读取OD340,并记为A2。随后每隔1 min读取OD340至读数稳定。样品μg=ΔAsample/ΔAstandard × 4 μg standard。

表 2 试剂盒检测体系 Tab. 2 Kit detection system
Component Blank (μL) Sample (μL) standard (μL)
distilled water 210 200 200
sample solution / 10 /
standard solution / / 10
solution 1 (buffer) 20 20 20
solution 2 (NAD+) 10 10 10
1.2.3 EmGalase对猪红细胞Galα1-3Gal表位的作用

将采集的猪血与CPDA-1血液保存液按照10:1.5比例混合。4 000 rpm离心7 min并去除上清液和白细胞层,余下红细胞与CPDA-1按照10:1.5比例混合, 重悬红细胞。取1 mL 10%的红细胞悬液,1 500 rpm离心2 min,用PCBS(60 mmol NaH2PO4, 25 mmol NaCitrate, 75 mmol NaCl)洗涤2次,并调至40%压积备用。

显微镜镜检:EmGalase酶切猪红细胞的镜下观察实验按照表 3加样。

表 3 猪红细胞的酶切体系(镜检) Tab. 3 Enzyme digestion system of porcine erythrocytes (Microscopic examination)
Component 1 2
40% porcine erythrocytes (μL) 40 40
PCBS(μL) 40 /
EmGalase(μL) / 40

室温反应1 h后,将红细胞1 500 rpm离心2 min,pH7.4 PBS洗涤2次,并调至10%压积。取10 μL红细胞与2 μL BSI-B4混合于载玻片上,显微镜(10×40)下观察。

流式细胞仪检测:按照表 4设置不同的组别进行酶切实验。

表 4 猪红细胞的酶切体系(流式检测) Tab. 4 Enzyme digestion system of porcine erythrocytes (flow cytometry)
Component 1 2 3
40% porcine erythrocytes (μL) 40 40 40
PCBS(μL) 40 40 /
EmGalase(μL) / / 40

室温反应1 h,期间液体保持混匀状,无沉降。反应后每管加200 μL pH7.4 PBS,1 500 rpm离心2 min,洗涤2~3次,200 μL pH 7.4 PBS重悬,取30 μL重悬液,加500 μL 0.1%戊二醛固定不超过15 min,pH 7.2 PBS洗涤2~3次,200 μL pH 7.2 PBS重悬。BSI-B4-FITC按表 5进行分组添加。

表 5 各组别的凝集素处理 Tab. 5 BSI-B4-FITC treatment in each group
Component 1 2 3
BSI-B4-FITC(μL) / 3 3
pH 7.2 PBS(μL) 3 / /

避光反应1 h,期间液体保持混匀状,无沉降。反应后用pH 7.2 PBS洗2~3次,稀释到一定细胞数后,用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司生产)进行荧光检测。

1.2.4 EmGalase对人B型红细胞Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位的作用

取1 mL 10%的B型红细胞悬液置1.5 mL EP管中,1 500 rpm离心2 min,去上清液,PCBS洗涤2次,调至40%压积。EmGalase对B型红细胞修饰的实验按表 6配制反应体系。室温反应1h后,将红细胞用pH7.4 PBS以1 500 rpm转速离心2 min,洗涤2次后,将红细胞调至10%压积。取10 μL红细胞与2 μL抗B型抗原抗体混合于载玻片上,显微镜(10×40)下观察。

表 6 人B型红细胞的酶切体系 Tab. 6 Enzyme digestion system of human B blood group red blood cells
Component 1 2
40% B-type red blood cell (μL) 40 40
PCBS(μL) 40 /
EmGalase(μL) / 40
2 结果 2.1 EmGalase基因的克隆、表达和纯化

借助CAZy数据库对FMS-007糖苷酶进行分析,发现了一个GH27家族的α-半乳糖苷酶EmGalase。进化树分析发现,EmGalase与已报道的两个可以修饰猪红细胞的酶(Coffea arabica GH27和Bacteroides fragilis NCTC 9343 GH110)有显著差异(图 1)。EmGalase基因序列长为1 104 bp,测序鉴定重组质粒构建成功后,将重组质粒pET-28a+-EmGalase转化至BL21(DE3)中诱导表达。纯化后的EmGalase相对分子质量为41 600,在SDS-PAGE中显示为单一条带,纯度在95%以上(图 2)。纯化的蛋白浓度为1~2 mg/mL(Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测定)。

图 1 EmGalase与代表性α-半乳糖苷酶的系统发生树分析 Fig. 1 Phylogenetic tree of EmGalase in representative alpha galactosidase
Lane 1: PageRuler Prestained Protein Ladder. Lanes 2, 3, 4 and 5: EmGalase eluted with different concentrations of imidazole. 图 2 EmGalase纯化及SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified EmGalase
2.2 EmGalase的酶学性质

为验证EmGalase是否具有α-半乳糖苷酶活性,我们用纯化的EmGalase处理人工合成的pNP单糖底物。结果显示EmGalase可水解pNP-α-Gal,但对其他底物无反应性,提示EmGalase是具有α-Gal特异性的糖苷水解酶(图 3)。EmGalase的催化常数Kcat为2.17 s-1,米氏常数Km为0.22 mmol,Kcat/Km为9.86 L/s·mmol,Vmax为0.19 μmol/s(图 4)。

图 3 EmGalase与pNP底物的反应 Fig. 3 The reaction between EmGalase and pNP substrate
A: Standard curve. B: Michaelis constant curve. 图 4 EmGalase反应的标准曲线与米氏常数曲线 Fig. 4 Standard curve and Michaelis constant curve related to EmGalase

EmGalase在pH3.0~8.0均表现出较高的反应活性(图 5A),活性反应的适宜温度区间为4~45 ℃(图 5B)。与对照相比,在相同反应条件下另外加入10 mmol浓度的金属离子时,Zn2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+、K+和Ca2+对EmGalase的半乳糖苷酶活性无明显影响,而Cu2+和Fe2+对酶活性有一定程度的抑制作用(表 7)。

A: EmGalase optimum pH. B: EmGalase optimum temperature. 图 5 EmGalase最适pH和最适温度 Fig. 5 EmGalase's optimum pH and optimum temperature
表 7 金属离子和化合物对EmGalase反应活性的影响 Tab. 7 Effect of ions and compounds on EmGalase
Reagents Concentration (mmol) Relative activity(%)
K+ 10 101.07
Mn2+ 10 117.64
Mg2+ 10 102.25
Ni2+ 10 101.77
Zn2+ 10 98.62
Ca2+ 10 96.04
Cu2+ 10 73.07
Fe2+ 10 47.81
EDTA 10 96.42
SDS 10 83.62

为了确认EmGalase所酶切的α-糖苷键特性,我们用该酶处理不同连接方式的寡糖,利用质谱和试剂盒分析反应产物。

质谱结果显示,EmGalase能够酶切直链末端α-1, 3、1, 4、1, 6连接的半乳糖。在酶切Galα1-3Galβ1-4Glc三糖的实验中,对照组使用高温失活EmGalase,检测到m/z 527.16处的分子离子峰,其表示该三糖的钠加合物。通过EmGalase处理后该峰消失,在m/z 365.11和203.05处出现两个强质量离子峰,表示有Galβ1-4Glc二糖的钠加合物和单糖Gal的钠加合物(图 6A)。在对Galα1-4Galβ1-4Glc三糖进行处理时也得到了类似的结果,EmGalase使得三糖的m/z 527.16峰转变为二糖的m/z 365.11和单糖的m/z 203.05(图 6B)。在使用蜜二糖Galα1-6Glc作为底物并用高温失活EmGalase进行对照实验时,可以观察到m/z 365.11的钠加合物;当用EmGalase处理之后,二糖峰消失,转变为m/z 203.05 Gal和Glc混合的单糖峰(图 6C)。上述结果提示,EmGalase既能酶切直链末端α-1, 3连接的半乳糖,又能酶切α-1, 4和α-1, 6连接的半乳糖(图 6)。

A: Before and after EmGalase digestion of Galα1-3Galβ1-4Glc(isoglobotriose). B: Before and after EmGalase digestion of Galα1-4Galβ1-4Glc(Pk antigen). C: Before and after EmGalase digestion of Galα1-6Glc(melibiose). 图 6 EmGalase处理寡糖底物后产物的质谱检测 Fig. 6 Mass Spectrometric Detection of Oligosaccharide Substrate digested by EmGalase

对水解后的单糖底物进行分析(D-Galactose kit)发现,在相同反应条件下,EmGalase能够不同程度地水解直链末端α-1, 3、1, 4、1, 6Gal,实验中未检测到EmGalase对α-1, 4连接的半乳糖寡糖的酶切活性(表 8)。

表 8 EmGalase对不同寡糖底物的反应性 Tab. 8 EmGalase reactivity to oligosaccharide substrates
Substrate Relative activity(%)
Gal-α-pNP 96.67
Galα1-3Galβ1-4Glc(isoglobotriose) 48.56
Galα1-4Galβ1-4Glc(Pk antigen) 58.85
Galα1-6Glc(melibiose) 81.85
GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc (globoside Gb4) ND
ND: means not detectable.
2.3 EmGalase对猪红细胞Galα1-3Gal表位的作用

在PCBS溶液中,用EmGalase处理猪红细胞表面Galα1-3Gal表位,并用特异性结合末端α-Gal的凝集素BSI-B4进行检测。结果显示,未经酶解处理的猪红细胞与BSI-B4发生强凝集反应,产生大小不一的团块;而经EmGalase处理后的猪红细胞与BSI-B4混合后,多个视野观察下未见任何凝集现象。结果提示EmGalase能够有效清除猪红细胞表面异种Galα1-3Gal表位。

为了进一步证实EmGalase的清除是否彻底,我们用BSI-B4-FITC进行检测。结果显示,在经过酶切处理前,由于猪红细胞表面存在大量的末端Galα1-3Gal,因此会与BSI-B4-FITC结合并检测到很强的荧光信号。而经EmGalase酶切处理后,猪红细胞与BSI-B4-FITC失去结合作用,其信号与无荧光的细胞对照信号基本一致,表明在实验条件下EmGalase能以95%以上的效率清除猪红细胞表面Galα1-3Gal表位(图 8)。

A: Untreated porcine red blood cells together with BSI-B4. B: EmGalase-treated porcine erythrocytes are associated with BSI-B4. 图 7 EmGalase对猪红细胞Galα1-3Gal介导凝集反应的影响(10×40) Fig. 7 Effect of EmGalase treatment on porcine erythrocytes Galα1-3Gal mediated agglutination (10×40)
NC: non-specific control. P: Untreated porcine red blood cells together with BSI-B4. P-EmGalase: EmGalase-treated porcine erythrocytes are associated with BSI-B4. 图 8 流式细胞术检测EmGalase对猪红细胞Galα1-3Gal的酶切活性 Fig. 8 Flow cytometry to detect EmGalase activity on porcine erythrocytes Galα1-3Gal
2.4 EmGalase对人B型红细胞Galα1-3(Fucα1-2) Gal表位的作用

B型红细胞表面B抗原糖链末端存在Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位[16],该表位上的末端α-Gal可被已报道的两个α-半乳糖苷酶清除。在PCBS溶液中,用EmGalase酶切处理人B型红细胞后,再用抗B血型抗原的单克隆抗体进行检测。结果显示,没有EmGalase处理的B型红细胞与抗B抗原抗体发生强凝集反应,产生大小不一的团块;而经EmGalase处理后的人B型红细胞与抗B抗原抗体混合后,在多个视野下仍然可观察到凝集现象(图 9)。提示EmGalase对人B型红细胞上的Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位无作用(不同酶用量及反应条件下均无效果,结果未显示)。

A: Untreated B-type red blood cells together with B antibody. B: EmGalase-treated B-type red blood cells together with B antibody. 图 9 EmGalase对人B型红细胞Galα1-3(Fucα1-2)Gal介导的凝集反应的影响(10×40) Fig. 9 Effect of EmGalase treatment on human B red blood cell Galα1-3(Fucα1-2)Gal mediated agglutination (10×40)
3 讨论

α-半乳糖苷酶常见于植物、动物和微生物中,而此前未有关于Em的α-半乳糖苷酶报道。EmGalase属于GH27家族,与GH4、GH36、GH57、GH97和GH110家族的α-半乳糖苷酶在进化上有着明显的差异。以pNP-α-Gal为底物,该酶在pH3.0~8.0之间都有较高的活性,尤以pH7.0时最优;反应温度在4~45 ℃,以20 ℃时的反应效果更好。EmGalase的反应pH值和温度范围较其他来源的同族半乳糖苷酶更广泛[6],最适反应条件温和,可以适应不同处理条件的要求。除铜离子和亚铁离子之外,其他常见金属离子的存在并不会影响EmGalase的活性。

在实验条件下,EmGalase能够以>95%的效率清除猪红细胞表面Galα1-3Gal表位,但对B型红细胞表面相似的Galα1-3(Fucα1-2)Gal抗原不起作用。EmGalase是第1个细菌来源可以作用于猪红细胞表面Galα1-3Gal表位的GH27家族α-半乳糖苷酶。2003年,Wang等用植物咖啡豆来源的GH27家族α-半乳糖苷酶修饰猪红细胞表面Galα1-3Gal表位[17]。2012年,Liu等报道脆弱类杆菌中α-半乳糖苷酶也能够作用于猪红细胞,属GH110家族。这两个酶存在共同的隐患是它们也能够清除存在于人类红细胞上B抗原Galα1-3(Fucα1-2)Gal的末端α-Gal[18-20]。与之相比,EmGalase专一性处理猪红细胞表面的异种抗原,将会降低在应急情况下异种输血中可能存在的不确定性。

事实上,末端半乳糖基化不仅是一种常见的免疫原,它在细菌的感染过程中也起着重要作用。革兰阴性菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)由脂质A、核心多糖和O抗原组成[21]。研究表明,在以肺炎克雷伯菌为代表的一些细菌中,LPS的O抗原上存在末端α-1, 3Gal结构[22-23]。这一结构在细菌感染过程中所起的作用有待进一步探究,EmGalase的酶切活性将为研究该过程提供一种工具。研究表明,在肾脏和肠道中存在末端α-1, 4Gal,该结构可能成为志贺菌所产生的志贺毒素特异性黏附作用的靶点[24],由此进入细胞产生毒素作用。EmGalase处理靶细胞是否能够阻断病原体的感染也是一个可能的研究方向。

综上所述,本研究克隆并表达了Em中GH27家族的α-半乳糖苷酶,发现其反应条件温和,可作为工具酶有效清除猪红细胞表面半乳糖相关的异种抗原,为应急情况下的异种输血提供一种新的途径。该酶在外源细胞与宿主相互作用中的应用值得进一步关注和研究。

参考文献
[1]
Huai G, Qi P, Yang H, Wang Y. Characteristics of α-Gal epitope, anti-Gal antibody, α1, 3 galactosyltransferase and its clinical exploitation (Review)[J]. Int J Mol Med, 2016, 37(1): 11-20. [DOI]
[2]
Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, Cheong HT, Greenstein JL, Im GS, Samuel M, Bonk A, Rieke A, Day BN, Murphy CN, Carter DB, Hawley RJ, Prather RS. Production of α-1, 3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning[J]. Science, 2002, 295(5557): 1089-1092. [DOI]
[3]
Reardon S. New life for pig-to-human transplants[J]. Nature, 2015, 527(7577): 152-154. [DOI]
[4]
高红伟, 张雪, 李素波, 檀英霞, 鲍国强, 王颖丽, 徐丽娟, 季守平, 宫锋. 新型α-半乳糖苷酶清除动物红细胞表面αGal抗原的研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2012, 20(5): 1231-1234. [URI]
[5]
Helbert W, Poulet L, Drouillard S, Mathieu S, Loiodice M, Couturier M, Lombard V, Terrapon N, Turchetto J, Vincentelli R, Henrissat B. Discovery of novel carbohydrate-active enzymes through the rational exploration of the protein sequences space[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(13): 6063-6068. [DOI]
[6]
李楠, 李苏红, 徐杰, 李润国, 董墨思. α-半乳糖苷酶的催化机理及底物特异性[J]. 粮油食品科技, 2014, 22(3): 92-97, 108. [DOI]
[7]
Stone KR, Walgenbach AW, Turek TJ, Somers DL, Wicomb W, Galili U. Anterior cruciateligament reconstruction with a porcine xenograft: a serologic, histologic, and biomechanical study in primates[J]. Arthroscopy, 2007, 23(4): 411-419. [DOI]
[8]
Ceyhan M, Celik M. Elizabethkingia meningosepticum (Chryseobacterium meningosepticum) infections in children[J]. Int J Pediatr, 2011, 2011: 215237. [PubMed]
[9]
孙桂芹, 李蒙, 王蕾, 郭航远, 俞洪, 陈菁, 陈力. 脑膜炎败血伊丽莎白金菌感染的临床分布及耐药性分析[J]. 中国微生态学杂志, 2014, 26(5): 540-543. [URI]
[10]
陈杏春, 农生洲. 脑膜败血伊丽莎白菌研究进展[J]. 检验医学与临床, 2013, 10(23): 3213-3215. [DOI]
[11]
Perrin A, Larsonneur E, Nicholson AC, Edwards DJ, Gundlach KM, Whitney AM, Gulvik CA, Bell ME, Rendueles O, Cury J, Hugon P, Clermont D, Enouf V, Loparev V, Juieng P, Monson T, Warshauer D, Elbadawi LI, Walters MS, Crist MB, Nobel-Wang J, Borlaug G, Rocha EPC, Criscuolo A, Touchon M, Davis JP, Holt KE, McQuiston JR, Brisse S. Evolutionary dynamics and genomic features of the Elizabethkingia anophelis 2015 to 2016 Wisconsin outbreak strain[J]. Nat Commun, 2017, 8: 15483. [DOI]
[12]
Sun G, Wang L, Bao C, Li T, Ma L, Chen L. Complete genome sequence of Elizabethkingia meningoseptica, isolated from a T-Cell non-Hodgkin's lymphoma patient[J]. Genome Announc, 2015, 3(3): e00673-15. [DOI]
[13]
李蒙, 孙桂芹, 陈菁, 李天胜, 王蕾, 策力木格, 陈力. N-糖苷酶基因在脑膜炎败血伊丽莎白金菌临床分离株中的分布[J]. 微生物与感染, 2014, 9(4): 224-229. [URI]
[14]
Sun G, Yu X, Bao C, Wang L, Li M, Gan J, Qu D, Ma J, Chen L. Identification and characterization of a novel prokaryotic peptide: N-glycosidase from Elizabethkingia meningoseptica[J]. J Biol Chem, 2015, 290(12): 7452-7462. [DOI]
[15]
Li T, Li M, Hou L, Guo Y, Wang L, Sun G, Chen L. Identification and characterization of a core fucosidase from the bacterium Elizabethkingia meningoseptica[J]. J Biol Chem, 2018, 293(4): 1243-1258. [DOI]
[16]
Liu QP, Sulzenbacher G, Yuan H, Bennett EP, Pietz G, Saunders K, Spence J, Nudelman E, Levery SB, White T, Neveu JM, Lane WS, Bourne Y, Olsson ML, Henrissat B, Clausen H. Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells[J]. Nat Biotechnol, 2007, 25(4): 454-464. [DOI]
[17]
Wang JX, Gao X, Bai Y, Ren HM, Tan YX, Zhang YP. Rudimentary study on humanization of porcine red blood cells: Enzymatic removal of galactose-alpha l, 3-galactose antigen from porcine red blood cell[J]. Chinese Sci Bull, 2003, 48(4): 343-345. [DOI]
[18]
Liu QP, Yuan H, Bennett EP, Levery SB, Nudelman E, Spence J, Pietz G, Saunders K, White T, Olsson ML, Henrissat B, Sulzenbacher G, Clausen H. Identification of a GH110 subfamily of alpha 1, 3-galactosidases: novel enzymes for removal of the alpha 3Gal xenotransplantation antigen[J]. J Biol Chem, 2008, 283(13): 8545-8554. [DOI]
[19]
Li SB, Gao HW, Ji SP, Wang YL, Xu LJ, Bao GQ, Tian SG, Yu CY, Tan YX, Gong F. The effect of treatment with alpha glycosidases from Bacteroides fragilis on the survival of rat erythrocytes in the circulation[J]. Blood Transfus, 2014, 12(Suppl 1): s204-s208. [PubMed]
[20]
Zhu A, Leng L, Monahan C, Zhang Z, Hurst R, Lenny L, Goldstein J. Characterization of recombinant alpha-galactosidase for use in seroconversion from blood group B to O of human erythrocytes[J]. Arch Biochem Biophys, 1996, 327(2): 324-329. [DOI]
[21]
周巾煜, 李倩倩, 黄纯翠, 武红梅, 李岩. 细菌脂多糖及其寡糖链结构分析技术研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 2017, 44(1): 49-57. [URI]
[22]
Galili U, Mandrell RE, Hamadeh RM, Shohet SB, Griffiss JM. Interaction between human natural anti-alpha-galactosyl immunoglobulin G and bacteria of the human flora[J]. Infect Immun, 1988, 56(7): 1730-1737. [URI]
[23]
Vinogradov E, Frirdich E, MacLean LL, Perry MB, Petersen BO, Duus JØ, Whitfield C. Structures of lipopolysaccharides from Klebsiella pneumoniae. Elucidation of the structure of the linkage region between core and polysaccharide O chain and identification of the residues at the non-reducing termini of the O chains[J]. J Biol Chem, 2002, 277(28): 25070-25081. [DOI]
[24]
Stroud MR, Stapleton AE, Levery SB. The P histo-blood group-related glycosphingolipid sialosyl galactosyl globoside as a preferred binding receptor for uropathogenic Escherichia coli: isolation and structural characterization from human kidney[J]. Biochemistry, 1998, 37(50): 17420-17428. [DOI]

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郭雅萌, 侯琳琳, 沈旦枫, 邹琳, 王蕾, 李天胜, 孙桂芹, 陈力
GUO Yameng, HOU Linlin, SHEN Danfeng, ZOU Lin, WANG Lei, LI Tiansheng, SUN Guiqin, CHEN Li
作用于种属差异性表位的细菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鉴定和研究
Identification and analysis of an alpha galactosidase(EmGalase) acting on species-differentiated epitopes
微生物与感染, 2019, 14(3): 153-162.
Journal of Microbes and Infections, 2019, 14(3): 153-162.
通信作者
孙桂芹
E-mail:sunguiqin2001@163.com;
陈力
E-mail:lichen_bk@fudan.edu.cn
基金项目
国家新药创制重大专项(2014ZX09101-046-004);国家自然科学基金青年科学基金项目(31600644);浙江省水利水电装备表面工程技术研究重点实验室开放基金(2017SLKL004)

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