2019, Vol. 14
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的传染性疾病。据世界卫生组织统计，全球约25%的人为结核分枝杆菌潜伏感染(latent TB infection, LTBI)者，其中5%~10%可能会发展为活动性TB[1]。每年因Mtb感染而死亡的人数达100万人以上，LTBI者成为TB患者的主要来源[2]。因此，及早发现和治疗LTBI者是控制TB传播的有效手段。目前，广泛使用的TB疫苗——卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)，仅能对抗儿童的原发性感染，却无法阻止成年人潜伏期Mtb的复发感染[3]。国内外进入临床研究的疫苗多数用于预防Mtb早期感染，对LTBI的预防效果不佳。因此，选择Mtb早、晚期不同感染阶段相关抗原研制新一代TB疫苗的策略将是可行的。Lin等将Mtb早期分泌抗原Ag85B、SAT-6与潜伏感染相关抗Rv2660c蛋白相结合，开发了一种多阶段的H56疫苗，对Mtb潜伏感染能起到有效的治疗作用[4-5]。Fan等通过融合表达Ag85B-HspX-Rv1813-Rv2660c-Rv2623抗原研制的A1D4疫苗对小鼠Mtb潜伏感染亦表现出良好的免疫保护效果[6]。因此，本研究选取了Mtb在不同感染阶段表达的抗原构建了针对LTBI的DNA疫苗。
前期研究利用Rv3425、PPE26和Rv2029c优势抗原构建的抗LTBI DNA疫苗p-VAX1-Ag85B-Rv3425-v2029c(A39)在抗LTBI方面具有较好的保护性[7-9]。本研究在质粒DNA A39中导入PPE26基因，构建了质粒Ag85B-Rv3425-PPE26-Rv2029c (V569)，转染HEK293T细胞后检测其所编码的蛋白在真核细胞中的表达水平，在C57BL/6小鼠中检测其免疫学特性，在斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型中初步检测其保护效果，为研制抗LTBI DNA疫苗提供了依据。
1 材料与方法 1.1 材料6~8周龄C57BL/6小鼠和3~6月龄成年斑马鱼均购自广州赛柏诺生物科技有限公司，海分枝杆菌(Mycobacterium marinum, M. marinum)、BCG、A质粒、A3质粒、A39质粒均由复旦大学王洪海教授惠赠，地塞米松、RPMI 1640购自Sigma公司，三卡因购自广州宝汇生物科技有限公司，小鼠细胞因子γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)和预包被enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA)试剂盒购自GENEEZYME公司和深圳达科为生物有限公司，质粒抽提和纯化使用QIAGEN公司plasmid giga kit，PBS购自上海生物工程有限公司，聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂、内切酶和连接酶试剂均购自赛默飞公司，DMEM高糖培养基和新生小牛血清购自Gibco公司，小鼠淋巴细胞分离液购自Cedarlane公司，OADC、Middlebrook 7H9和Middlebrook 7H10购自BD Biosciences公司，羊抗鼠FITC-CD4和羊抗鼠PE-CD8抗体购自eBioscience公司。
1.2 方法 1.2.1 V569质粒的构建以Mtb H37Rv株基因组为模版，利用PCR扩增PPE26基因[10]，使用Bam HⅠ和Not Ⅰ双酶切A39 DNA质粒[11]，DNA连接酶连接酶切后的DNA片段，构建重组质粒V569，并使用双酶切和DNA测序对质粒进行鉴定。质粒构建所需引物见参考文献[10-11]。将A39和V569阳性克隆菌分别接种于3 mL LB液体培养基(含3 μL 1 μg/ml青霉素)，37 ℃摇床培养过夜，接种于100 mL LB液体培养基(含50 μL 1 μg/ml青霉素)扩大培养。质粒抽提和纯化后，采用NanoDrop 2000测定质粒DNA浓度。
1.2.2 重组质粒转染HEK293T细胞验证质粒编码蛋白在真核细胞的表达将HEK293T细胞接种于DMEM高糖培养基(含10%新生小牛血清)培养过夜，待细胞密度达到80%时，使用罗氏脂质体Lipo3000将重组质粒DNA(1 μg/皿)转染细胞。对照组转入1 μg对照质粒pVAX1和A39。转染48 h后收集细胞，用蛋白免疫印迹法检测细胞内质粒DNA编码蛋白的表达情况，所用一抗为抗Rv3425和抗PPE26小鼠血清抗体。
1.2.3 小鼠免疫将C57BL/6小鼠分为6组，分别为PBS组、A组、A3组、A39组、V569组和BCG组，每组5只。BCG悬浮于PBS中，终细菌计数2×107 CFU/mL。各组DNA质粒均溶于PBS中，终浓度为1 mg/mL。免疫程序：向小鼠左后腿肌内注射50 μL PBS和BCG(1×106 CFU)、A、A3、A39、V569组各50 μg DNA。每2周免疫1次，共免疫3次。最后一次免疫2周后处死小鼠，并测定各项免疫指标。
1.2.4 流式细胞术检测眼球外周血CD4+ T细胞和CD8+ T细胞免疫2周后，取小鼠眼球外周血并置于含肝素抗凝剂(50 U/mL)的试管内，立即混匀。取100 μL抗凝外周血于5 mL试管中，加入2 mL红细胞裂解液，立即轻轻混匀，在室温下避光孵育3 min。然后以2 000 r/min离心2 min，将沉淀物重悬于PBS中，重复2次后加入相应的荧光标记抗体(FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8)，避光孵育30 min后洗涤，重悬于PBS中。滤膜过滤后使用流式细胞仪(Attune NxT，赛默飞公司)检测，用FlowJo 7.软件对数据进行分析。
1.2.5 脾淋巴细胞分离和培养将小鼠置75%乙醇消毒5 min后无菌分离脾脏。经200目钢网研磨，制备脾细胞悬液。加入4 mL淋巴细胞分离液后在4 ℃以1 000 r/min离心10 min，小心吸取双层液面之间的淋巴细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次。计数后，将淋巴细胞悬液按照2.5×105个/孔加至24孔板中。每组细胞分别用Ag85B、Rv2029c、Rv3478和PPE26抗原刺激，浓度为10 μg/mL。混合均匀后，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养36 h。
1.2.6 ELISA检测脾淋巴细胞上清液中IFN-γ、IL-4的水平各组脾淋巴细胞经抗原刺激后，收集上清液用于细胞因子检测，所用试剂盒为小鼠IFN-γ和IL-4预包被ELISA试剂盒。将上清液以100 μL/孔加入96孔平板中，同时设空白孔。37 ℃孵育60 min，洗涤3次后，每孔加入生物素标记的抗小鼠IL-4或IFN-γ抗体100 μL。37 ℃孵育60 min，洗涤3次后，每孔加入生物素标记二抗100 μL。37 ℃孵育30 min，洗涤3次后，每孔加入OPD底物100 μL，避光15 min，每孔加入终止液100 μL。使用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)后，根据标准曲线计算出样品中IFN-γ和IL-4的浓度。
1.2.7 斑马鱼潜伏感染模型的构建将海分枝杆菌接种于7H9培养基(7H9+0.2% Tween 80+10% OADC增菌液)，调OD600值至0.5左右。用0.02%三卡因溶液麻醉成年斑马鱼1~2 min。用无菌PBS稀释至8×103海分枝杆菌，通过微量注射器和腹腔注射方式向斑马鱼注射5 μL低剂量菌液(30~50 CFU/条)[12]。为检验细菌注射的数量，将5 μL低剂量稀释后菌液涂布于7H10固体培养基(7H10+10% OADC增菌液)中，计算细菌菌落数为33±11CFU。4周后，斑马鱼全身切片行抗酸染色检测病理状况。同时，为进一步检测斑马鱼潜伏感染模型是否成功建立，我们使用微量注射器向斑马鱼腹腔内注射5 μL高剂量菌液(2561±238 CFU)，分别统计斑马鱼在注射低剂量和高剂量菌液后的存活率[12]。
1.2.8 斑马鱼脏器菌落计数斑马鱼海分枝杆菌潜伏感染模型建立后，用DNA疫苗对斑马鱼进行免疫。实验共分6组，每组60条斑马鱼。免疫过程：各组分别腹腔内注射50 μL PBS、BCG、A、A3、A39和V569。其中，BCG含量为1×106 CFU，质粒含量均为各10 μg。免疫4周后使用地塞米松饲料进行饲养，每条鱼给予饲料4 mg/d(即地塞米松10 μg/d)，持续饲养4周，进行免疫抑制以复活潜伏海分枝杆菌。复活后第1、2周每组分别取5条斑马鱼处死，用于脏器菌落计数。取斑马鱼肝脏在无菌PBS中洗涤，放入组织研磨器后，加入无菌生理盐水1 mL，制成组织匀浆液。分别取10 μL接种于OADC平板培养基上，37 ℃培养4周后进行菌落计数，对比不同时间组、不同免疫组之间脏器菌落形成单位计数的差异。在实验过程中统计斑马鱼死亡数量，绘制生存曲线。
1.2.9 统计学分析所有实验数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，免疫学实验进行t检验分析，生存曲线进行了Log-rank分析，结果用算术平均数±标准差(X±SD)表示。小鼠免疫学特性和保护性实验实施了3次独立实验。P＜0.05为统计有显著性差异。
2 结果 2.1 重组质粒DNA编码蛋白可在转染HEK293T细胞表达将PPE26(1 182 bp)导入质粒A39 (2 568 bp)中，构建了质粒V569(为3 750 bp)(图 1A)。质粒V569经双酶切后，可产生A39和PPE26两个片段(图 1B)。
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| A: PCR products of A39 and V569 analyzed by agarose gel electrophoresis. B: Digested products of A39 and V569 analyzed by agarose gel electrophoresis. C: Western blotting analysis of the expression of Rv3425 using anti-Rv3425 antibody. D: Western blotting analysis of the expression of PPE26 using anti-PPE26 antibody. 图 1 蛋白免疫印迹法检测重组质粒DNA在HEK293 T细胞中的表达 Fig. 1 The protein expression in HEK293T transfected with the constructed DNA by Western blotting |
将A39和V569质粒分别转染细胞后，蛋白免疫印迹法检测重组蛋白表达。用抗Rv3425抗体检测重组质粒表达，结果显示，质粒V569转染细胞后，在蛋白相对分子质量(Mr)为110~175 kD处有明显条带；而质粒A39转染细胞后，在72~110 kD处有明显条带(图 1C)。用抗PPE26抗体检测重组质粒表达，结果显示，质粒V569转染细胞后在Mr为110~170 kD处有明显条带，而经A39和pVAX1转染的细胞无条带(图 1D)。以上表明V569编码蛋白可在真核细胞中表达。
2.2 质粒V569免疫小鼠可以促进外周血CD4+、CD8+T细胞的增殖取小鼠眼球外周血，用荧光标记抗体CD4+和CD8+分别标记T细胞，流式细胞仪进行检测。各组免疫后小鼠眼球外周血中CD4+和CD8+ T细胞所占比例见表 1。相比PBS，BCG、质粒A39和V569均明显刺激了外周血中CD4+T细胞，数量显示增加(图 2A)。与A39免疫组相比，V569免疫组中CD4+ T细胞数量并无变化，CD8+ T细胞数量有所下降，但无显著性差异(图 2A和表 1)。同时，比较各组中CD4+ T/CD8+ T细胞比值，质粒V569免疫组中该比值为1.437±0.186，明显高于质粒A免疫组(1.163±0.241)、质粒A3免疫组(1.223±0.183)和BCG免疫组(1.257±0.267)；与质粒A39免疫组(1.355±0.208)相比，前者CD4+/CD8+ T细胞比值略有升高，但无显著性差异(图 2B)。这表明V569可引起较强烈的CD4+ T细胞免疫反应。
| CD4+ T cell (%) | CD8+ T cell (%) | CD4+/CD8+ T cell (%) | |
| PBS | 13.55±1.450 | 12.95±0.730 0 | 1.048±0.271 |
| BCG | 19.67±1.38 | 15.64±1.49 | 1.257±0.267 |
| A | 18.55±1.450 | 15.95±2.13 | 1.163±0.241 |
| A3 | 19.13±1.450 | 15.95±0.730 0 | 1.223±0.183 |
| A39 | 20.63±1.450 | 15.22±1.53 | 1.355±0.208 |
| V569 | 20.80±1.97 | 14.49±1.27 | 1.437±0.186 |
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| A: the percent of CD4+ T cell in in serum of mice immunized with PBS, A, A3, A39 and V569. B: the ration of CD4+/CD8+ T cell in serum of mice immunized with PBS, A, A3, A39 and V569. *:P < 0.05; n.s.: no difference. 图 2 V569对外周血CD4+、CD8+T细胞增殖的影响 Fig. 2 The effect of v569 vaccination on CD4+ and CD8+ T cell in mice |
取免疫后小鼠脾淋巴细胞，分别经特异性抗原Ag85B、Rv3425、PPE26和Rv2029c刺激后，采用ELISA检测细胞培养上清液中的IFN-γ和IL-4分泌水平。如图 3A所示，与PBS对照组相比，V569免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中的抗原特异性IFN-γ水平明显升高(分别经Rv3425、PPE26和R2029c刺激，P < 0.05)。与其他各组相比，A39、V569免疫组中IL-4的分泌水平略有减少(分别经Rv3425、PPE26和R2029c刺激，P>0.05)，但各组间无显著差异，见图 3B。以上结果提示质粒V569可以诱导较强的细胞免疫应答。
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| A: The concentrations of IFN-γ in splenocytes response to Ag85B, Rv3425, PPE26 and Rv2029c treatment. B: The concentrations of IL-4 in splenocytes response to Ag85B, Rv3425, PPE26 and Rv2029c treatment. *:P < 0.05. 图 3 脾淋巴细胞培养上清液中特异性细胞因子分泌水平 Fig. 3 Concentrations of IFN-γ and IL-4 in supernatants of mouse splenocytes after vaccination |
利用斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型评价DNA疫苗抗潜伏感染保护效率(图 4A)。斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型建立后，经斑马鱼全身切片抗酸染色观察到了肉芽肿类似结构(图 4B)。肉芽肿结构形成反映了TB发生的病理阶段[12]。与高剂量海分枝杆菌感染相比，低剂量菌液感染后，斑马鱼存活时间明显延长(图 4C)，提示斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型成功构建。
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| A: Schematic representation of the experimental protocol for testing vaccine candidates against the reactivation of a latent M. marinum infection in zebrafish. B: Acid-fast staining in zebrsfish-M. marinum latent infection model. C: The survival curve of zebrafish infected with low-dose or high-dose bacteria. D: The survival curve of zebrafish after vaccination. E: colony-forming units (CFU) in zebrafish liver. *:P < 0.05; **:P < 0.001; n.s.: no difference. 图 4 V569抗潜伏感染的保护效率 Fig. 4 The protective efficiency of DNA vaccine V569 in zebrafish model |
将该模型用于评估疫苗抗潜伏感染保护效应。与PBS、质粒A、质粒A3和BCG组相比，质粒V569组斑马鱼14 d存活率接近80%(图 4D)。肝脏细菌菌落计数结果显示，质粒V569组中细菌数量明显下降(图 4E)。与A39组相比，V569组斑马鱼存活时间延长，菌落计数均有所减少，但无显著性差异(图 4D、4E)。这表明质粒V569也许能抑制斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染的复发。
3 讨论DNA疫苗治疗LTBI是预防Mtb感染复发的有效途径[12]。本研究基于质粒A39 DNA构建了质粒V569 DNA疫苗，与BCG相比，质粒V569在小鼠体内可诱导更显著的Th1型细胞免疫反应；质粒V569对斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染复发表现出较好的保护效果，显著延长了病原菌感染后斑马鱼的存活时间。
Th1型细胞免疫反应对于Mtb感染所引起的机体免疫应答至关重要[13]。IFN-γ可促进Th0细胞增殖分化成Th1细胞和激活巨噬细胞，在抗Mtb感染中起重要作用[14]。本研究中，与PBS相比，质粒V569促进了小鼠淋巴细胞中IFN-γ分泌。IL-4是Th2细胞分泌的细胞因子，可抑制Th1细胞的增殖，拮抗IFN-γ的作用[15]。然而，本实验中PBS组小鼠淋巴细胞中IL-4分泌水平较高，与V569实验组相近。其中原因可能是：IL-4分泌水平在各组中可能都较高，故检测时PBS组与实验组差异不大；然而，IL-4分泌水平在各实验组中无差异，表明质粒V569不会促进免疫对象分泌IL-4。
CD4+ T细胞百分比是评价Mtb疫苗效果的重要指标。CD4+ T细胞可产生IFN-γ和IL-2，在清除Mtb过程中起关键作用。在Mtb潜伏感染模型中，CD4+ T细胞与病原菌活化密切相关[16]。CD8+ T细胞能溶解宿主细胞并参与清除Mtb[17]。在本试验中，与PBS、BCG组相比，V569组的小鼠眼球外周血中CD4+/CD8+T细胞比例均明显升高。与A39组相比，V569组中CD4+ T、CD8+ T细胞比例无显著差异。这可能是由PPE57(A39和V569均含有)引起的免疫交叉反应所致[18]。
斑马鱼-海分枝杆菌潜伏感染模型对于研究Mtb的感染、休眠和活化极为重要[12]，本实验利用该模型评估V569疫苗抗潜伏感染保护效率，免疫后可较为有效地诱导Th1型细胞免疫反应。因此，质粒V569对斑马鱼中低剂量海分枝杆菌潜伏感染的复发有较好的保护作用；虽然增加了RD5区PPE26抗原，但其免疫原性和保护性并无显著增强，可能是不同PPE抗原之间存在一定程度的免疫交叉反应[18]。本研究为研发新的抗LTBI的DNA疫苗提供了依据。
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