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  微生物与感染  2020, Vol. 15 Issue (3): 179-185      DOI: 10.3969/j.issn.1673-6184.2020.03.007
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纳米孔测序技术在病毒性传染病检测及研究中的应用
崔晓娴 , 李云逸 , 杨玉颖 , 张曦 , 李崇山     
上海市疾病预防控制中心病原生物检定所,上海 200336
摘要:快速、准确鉴定出病原体是临床感染性疾病诊断和传染病预防控制的基础。高通量测序基因检测技术突破了传统检测手段的时效性、灵敏度等的局限,为病原体检测和研究提供了便捷、高效的途径。本综述以高通量测序技术发展过程为基础,回顾纳米孔三代测序技术,及其在病毒性传染病检测鉴定及研究中的应用,并对该技术的应用前景及可能存在的问题进行阐述,期望它能在病毒性传染病的防控方面发挥更大的作用。
关键词病毒性传染病    分子诊断技术    高通量测序    纳米孔三代测序技术    
Application of nanopore sequencing technology in detection and study of viral infectious diseases
CUI Xiaoxian , LI Yunyi , YANG Yuying , ZHANG Xi , LI Chongshan     
Division of Microbiology, Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China
Abstract: Rapid identification of pathogens is the basis for clinical diagnosis and prevention and control of infectious disease. High throughput sequencing technology breaks through the limitation of traditional detection methods, such as timeliness and sensitivity, providing an efficient way for clinical detection and research. In this review, the development of high throughput sequencing technology was discussed, mainly by introducing the third-generation nanopore sequencing technology. At the same time, the application of nanopore sequencing technology about the detection and study in viral infectious diseases were reviewed, and the application prospects and possible problems were prospected.
Keywords: Viral infectious diseases    Molecular diagnostic    High throughput sequencing    Three generation sequencing technology of nanopore    

在公共卫生领域尤其是传染病的预防控制中,快速明确传染源或病原体是处理突发公共卫生事件并有效控制疫情的基础。传统的病原体检测手段,如经典的微生物分离和培养方法等,由于存在操作复杂、耗费时间、灵敏度不高等问题,在临床的应用中受到很大限制。随着20世纪分子生物学的飞跃发展,各种分子诊断技术和核酸检测方法已逐步成为公共卫生与临床检验领域的重要工具。基因测序技术作为分子生物学研究中最为重要的技术手段之一,一代桑格尔(Sanger)测序成为许多疾病分子诊断的“金标准”。2005年,自从生命科学公司(Life Science,美国)推出具有革命性的基于焦磷酸测序法的高通量测序技术开始[1],Illumina公司(美国)及罗氏公司(Roche,瑞士)不断开发并优化出新的测序平台,其中包括Roche GS-FLX 454、Illumina Solexa、IlluminaMiseq/Hiseq、ABI SOLiD等(表 1)。二代测序技术(second generation sequencing, SGS)经过数十年的发展,因其不断提高的测序通量、不断降低的测序成本、速度快及准确性高而被广泛应用于疾病的检测和研究,在感染性疾病诊断、传染病预防控制、微生物基因组学研究等领域发挥着越来越重要的作用[2]。近些年来,以单分子实时测序、长片段读长为特征的三代测序技术(third generation sequencing, TGS)飞速发展[3]。2014年英国牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)推出了第1个商品化的便携式纳米孔测序仪MinION,这标志着另一种三代测序技术——纳米孔测序技术正式进入基因测序领域[4]。本综述对纳米孔测序技术原理及特点进行介绍,并重点回顾其在病毒基因组检测和研究中的应用,以及该技术方面具代表性的研究进展。

表 1 常见的高通量测序平台 Tab. 1 Common high throughput sequencing platforms
平台名称 扩增方式 测序方式 读长 通量 错误类型/
错误率
GS FLX T滴XL+
GS FLX T滴XLR70
(罗氏454,瑞士)
乳化液PCR 焦磷酸测序 <1 kb
<600 bp
23 h可达700 Mb
10 h可达450 Mb
插入缺失/0.5%
Genome Analyzer IIx
MiSeq (因美那,美国)
桥式PCR 边合成边测序可逆性末端终终 35~150 bp
36~250 bp
2~14 d可达10~95 Gb
4~39 h可达540 Mb~8.5 Gb
置换错误/0.2%
5500xl SOLiDTM system
SOLiDTM 4 system
(赛默飞,美国)
乳化液PCR 连接法测序 35~75 bp
25~50 bp
1 d可达10~15 Gb
3.5~16 d可达
25~100 Gb
置换错误/0.1%
Ion ProtonTM sequencer
(Proton I chip)
Ion PGMTM sequencer
(318 chip) (赛默飞,美国)
乳化液PCR 离子半导体
测序
<200 bp 2~4 h可达10 Gb
0.9~4.5 h可达
300 Mb~1 Gb
插入缺失/1%
PacBio RS (太平洋生物科
学公司,美国)
无需扩增 单分子测序 250 bp~
10 Kb
无限 插入缺失/10%
MinION (牛津纳米孔公司,
英国)
无需扩增 单分子测序 Variable 无限 插入缺失/10%
1 纳米孔三代测序技术简介

纳米孔测序技术最初的开发起源于20世纪80年代,通过对金黄色葡萄球菌α溶血毒素和耻垢分枝杆菌毒素蛋白A[5-6]等纳米孔通道及DNA解旋酶的一系列研究和优化[7],科学家经过不断的技术革新,提高了纳米孔通道对于单核苷酸测序精度的控制及传感器对核酸序列分析的能力,直至第一台商业化纳米孔测序仪MinION推出。现在纳米孔测序技术越来越多地被应用于生命科学及公共卫生等多个领域。

1.1 原理

不同于SGS“边合成边测序”的方法,纳米孔测序原理是采取“边解链边测序”的方法[7]。每张与MinION配套使用的流动池(flow cell)上含有512个传感器,每个传感器连有4个纳米孔,共计2 048个纳米孔镶嵌在人造脂质双分子层之间,被隔成正反2个腔室,腔室内充满着离子浓度不同的盐溶液,并在两端加载电极。测序开始后,正反腔室之间的电压使得核酸在通过纳米孔通道时因测序文库中的DNA末端含有特殊的Y形接头,可被纳米孔蛋白的DNA聚合酶所捕获,DNA聚合酶将双链DNA打开并引导其中一条单链穿过纳米孔。不同碱基在经过通道时,引起不同的电流干扰振幅被传感器记录下来,经过算法被电脑记录为不同的碱基字符。纳米孔中每通过一条核酸序列,记录下来的核苷酸信息会相应生成reads(高通量测序平台产生的序列),对应电脑中生成FAST5(后缀为Fast5的序列文档)文件。研究人员可根据不同的实验目的,通过不同的生物信息学分析流程提取所需要的信息,从而得到相应的结果。

1.2 特点

MinION仅为U盘一般大小,插入普通电脑即可运行。由于纳米孔测序设备体积小,对资源的需求相对较少,因此它在偏远和资源有限的地区具有巨大的应用潜力。与SGS相比较,纳米孔三代测序技术有如下优点:①理论上可检测通过孔通道的全部核酸序列,因此读长可以无限长,目前最长已可达882 kb[8]。目前,MinION测序平均长度可达20千碱基对(kilo base, kb)以上,最大reads长度可远远超过病毒基因组的长度,被认为在病毒基因组测序领域更占优势[6];同时,较长的reads有助于数据组装,尤其是对像疱疹病毒那样基因组含有大量重复序列或复杂结构的病原体。②测序文库制备过程简单、快速,平均制备过程仅需3~4 h;边测序边输出测序结果,因此测序数据可进行实时分析,在突发疫情处理的时效性上具有其他任何检测方法和平台都无可比拟的优势。MinION推出之初,在传染病应急检测和防控领域最为亮眼的表现也莫过于此。③设备便携性好,在较为复杂、苛刻的操作条件下, 比如在热带雨林、南极和国际空间站[9-11],也可开展测序工作;虽然下机后原始数据对单核苷酸的检测准确率有待提高(约为85%~89%)[12],但组装后经纠错与校正,碱基的准确度可达99.99%以上。根据ONT公布的最新数据,随着对纳米孔蛋白的不断优化和技术的改进,纳米孔三代测序下机数据准确率也有所提高。④与其他测序平台相比较,纳米孔测序是当前唯一可对碱基修饰和RNA直接测序的技术,错误率约为17.02%[13]。这一优势可避免目前对RNA病毒进行测序和研究时必须将RNA反转录为DNA扩增所产生的偏向性及可能引入的突变。尽管目前测序需要依赖RNA的poly A尾巴,但针对RNA直接进行测序的这一特点依然在RNA病毒检测领域具有巨大的吸引力。

2 纳米孔测序技术在病毒性传染病诊断及研究中的应用

高通量测序技术应用于传染病诊断领域的优势,在于以更高的灵敏度检出病原体的同时可获得其基因组信息,因此该技术在病原体鉴定及后续基因组的研究中都可发挥作用。目前对于病毒基因组测序策略主要有聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增子测序、宏基因组测序等方法[9]。在实际操作中,研究人员需根据不同的临床标本及测序目的,选择不同的策略对病毒进行扩增或富集,以应对不同的场景及研究。

2.1 纳米孔测序技术的应用策略及评估 2.1.1 基于PCR扩增子的测序策略

相较于其他高通量测序平台,纳米孔测序所需设备及试剂耗材非常便于携带,并且在测序过程中即可实时分析数据。因此自2014年以来,多个研究团队在偏远地区等资源条件不足的情况下利用纳米孔测序技术完成了疫情中的应急检测及未知病原的鉴定。Quick等[14]基于MinION设计了一整套实验室测序平台及工作流程,并将所有的设备打包空运至疫情发生地区。通过对2015年收集的142株埃博拉病毒标本进行基于扩增的全基因组测序,证实在疫情发生时,所搭建的纳米孔测序平台可在收到标本24h内获得分析结果。表明在有限的资源和条件下,纳米孔测序技术可应对埃博拉病毒感染疫情暴发及基因组实时监测。根据此经验,Hoenen等[15]也在埃博拉病毒感染疫情暴发期间,成功对来源不同、滴度不同的临床标本完成了对埃博拉病毒基因组的测序和分析。

Quick等[16]改进并优化了基于多重PCR的纳米孔三代测序技术并用于寨卡病毒基因组检测及分析,该方法详细介绍了引物在线设计工具、新型多重PCR富集方法、文库制备以及下机数据的生物信息学流程等,可在1~2d内通过靶向富集病毒基因组。基于扩增子测序对病毒进行特异性的靶向富集,大大增加了测序的灵敏度和特异度,可从 < 50个拷贝/反应的临床样品中获得寨卡病毒全基因组序列。此方法被南美洲巴西地区的Faria研究团队[17]成功应用于寨卡病毒的检测和分子流行病学的监测研究。2015—2016年共检测了收集到的1 349份临床标本及850份来自蚊子的标本,完成了寨卡病毒的进化分析。

2.1.2 基于非靶向扩增的宏基因组测序策略

近些年来,利用高通量测序或芯片技术对环境中全部病毒的基因信息进行研究的病毒宏基因组学已被广泛用于临床样本中病原体的发现以及对环境中病毒多样性的特性描述。Hansen等[18]利用随机等温扩增富集未知病毒和纳米孔测序技术,对含有寨卡病毒的组织培养物样本模拟不明原因的发热疫情,探索通过宏基因组分析检出目标病毒所需的时间。整个过程包括样品处理、文库制备、测序和使用离线数据库BLAST搜索进行数据分析。结果耗时不到7 h,共提取分析了63, 678个序列文件,涉及10, 000个碱基。但考虑到纳米孔测序对上样总量的要求,在本研究中所使用的样本来自组织培养物,并不能完全模拟临床标本的真实情况。

2.1.3 杂交靶向富集测序

靶向捕获测序最早用于人基因组外显子测序,与病毒基因组的靶向富集方法类似,通过病毒特异性的寡聚核苷酸探针与样本中病毒基因组杂交建库,达到富集病毒的目的。因病毒基因组较小和样本中病毒含量丰度较低,同时对于探针库需不断优化设计,目前此方法多用于SGS。

2.1.4 纳米孔测序检测能力评估

Wang等[19]评估了MinION与一代、二代(Illumina MiSeq)测序平台对流行性感冒(简称流感)病毒基因组的检测能力。发现由MiniON生成的基因组间核苷酸差异最小;同样的临床标本,MiniON运行4 h所产生的数据量可完成准确率高达99%的可靠基因组序列拼接。认为在流感大流行期间,可以利用纳米孔测序平台在现场直接分析样品,并对流感病毒亚型、基因重配、病毒毒力及抗病毒药物敏感性等毒株特征做出初步判断。

与SGS相比,纳米孔测序可实时获得测序结果分析并随时停止操作,可缩短测序运行的时间至7 min[20]即可达到与MiSeq测序结果98.7%的一致性。这些优点使得纳米孔测序技术在面临新发和再发传染病疫情暴发可能存在的极端实验条件及急需快速、准确测序结果时都具有十分广阔的前景。目前多个研究小组的真实操作经验及模拟研究均表明,纳米孔测序技术在此领域中的优势最为突出[9, -11]

2.2 纳米孔测序技术在病毒基因组研究中的应用 2.2.1 具有重复序列和复杂结构的病毒基因组研究

考虑到TGS的读长优势,利用纳米孔测序技术对基因组中存在重复序列和复杂结构的病毒(如疱疹病毒等)进行研究具有独特优势。研究者通过混合组装Roche 454和MiniON的reads,对7个样本的数据进行组装,成功获得了长达152 kb的单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)的基因组。该方法还从一例样本中检测到独有序列与重复序列区间的重排[6];另有研究小组利用纳米孔测序技术的重组装(de novo assembly)策略,先利用准确率较低的长重叠群构建基因组框架,再利用准确率较高的短重叠群对框架进行纠正,最终获得了235 kb的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)基因组序列[21],准确率可达98.8%。

2.2.2 病毒分子流行病学研究

Hansen等[22]基于纳米孔测序技术对手足口病病毒的分型进行了探索,从病毒RNA提取、反转录、第二链合成、文库制备、上机测序和数据分析全部过程在5 h内完成,共获得12 193个序列文件。同时通过离线数据库BLAST比对分析结果显示,针对P1区域的定型特异性可达98.3%。这些研究表明,纳米孔测序技术有望让高通量测序变得像实验室里最简单的基础实验一样便捷,在样本浓度较低或实验条件不足时对于一些常规的病毒分析及研究的方法﹝如酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和sanger测序﹞都是很好的补充和完善;而对于一些较为复杂、烦琐的检测(如基因组修饰[23]、耐药性检测[24]等),虽然目前缺乏在病毒方面应用和研究的报道,但相信随着技术的改进,一定会在更多的领域发挥其独特的优势。

2.2.3 病毒宏基因组学研究

相比较SGS,纳米孔测序技术长片段读长这一特点在检出未知病原时可获得较多基因组信息而具有无可比拟的优势,但也面临建库起始模板量较高的问题。纳米孔测序技术自问世以来,已有许多基于此的病毒宏基因组学研究[25-26]。有研究比对了Illumina及Nanopore测序平台对肯孔基雅热病毒和登革热病毒荧光定量核酸检测阳性的标本进行病毒全基因组测序的能力,并评估和确认了MinION的便携式测序方法在疫情暴发现场,利用宏基因组检测未知病原的潜在应用价值[27]。Joseph[28]利用纳米孔测序技术直接对20份委内瑞拉马病毒核酸阳性的Culex cedecei库蚊标本进行无偏向性宏转录组测序,结果发现与Illumina二代测序相比,纳米孔三代测序长片段的特点使得在利用BWA-MEM算法与参考基因组比对时,与参考基因组的匹配率有所下降,但灵敏度相当。但这些并不能抹杀MinION的便携性在应急检测的优势。在这些研究中,由于来自宿主基因组或其他背景的干扰,TGS与SGS同样都要考虑样本中病毒的丰度以及测序深度的问题。目前两类平台都具有彼此无法取代的优势,在实际应用时,两者互相配合及补充似乎是最佳的策略。

2.3 纳米孔测序技术在RNA病毒研究中的优势

纳米孔测序技术的另一特点是可以直接对各类形式的RNA进行测序[29-30],包括多顺反子、剪接变异体等结构复杂的RNA,并且当RNA浓度足够高时可达到97%~99%的一致性。同时,由于它兼具长片段读长,在从头组装、解决复杂区域及确定全长RNA分子方面的优势,也被认为更适宜用于病毒转录组的研究[31]。2018年尼日利亚拉撒热疫情暴发期间,研究人员在当地利用纳米孔测序平台对36份临床标本中的RNA直接进行测序,并与120份往年标本进行的回顾性分子进化分析研究发现,此次疫情存在独立的人兽共患传播事件,并排除了病毒发生突变而导致大规模人传人的可能性[32]。该研究证明了MinION无须特异性扩增甚至反转录,可直接从临床标本中准确检测RNA。Depledge等[33]通过RNA测序技术对HSV-1转录组直接进行测序分析,确定了HSV-1感染细胞期间转录子的转录起始位点和RNA剪切位点,同时仅通过低水平的转录子reads,发现一类新的可编码功能性蛋白质的嵌合型HSV-1转录本。因此TGS提供了一种有力的方法来描述具有复杂基因组的病毒在细胞内不断变化的转录情景。Viehweger等[34]利用纳米孔测序长读长及可直接对RNA进行测序的优势,并结合二代测序数据,拼接出27.3 kb与人229E型冠状病毒基因组高度一致的序列。同时,测序结果还显示感染细胞中存在多种新型病毒亚基因组RNA(sg RNA)。纳米孔测序技术提供了对病毒RNA甲基化修饰和其他复杂病毒种群基因组研究进行分析和探索的可能性。但目前对于这些探索性研究都需要大量的病毒样本来制备文库,同时为了弥补测序产生的错误,原始数据必须经过多次处理。基于纳米孔技术的迅速发展,Barnes等希望随着技术的进一步改进,能将常规流感和其他RNA病毒的直接测序成为常规[35]

MinION推出时所提到的对于核酸修饰的检测能力,虽被研究人员寄予厚望,但目前对于此部分的研究仍属空白。

3 结语

高通量测序技术的发展使得人类可更深入地了解微生物的变异、变迁和进化规律,更全面、准确地描述基因型、毒力、耐药谱等病原遗传背景的信息。与其他高通量测序平台相比,基于纳米孔测序技术的MinION测序仪具有低成本、长片段读长、小型化、易集成、时效性强等优势,近年来发展非常迅速,并逐步在基因测序领域占有一席之地。2019年年底在新型冠状病毒肺炎疫情中,纳米孔三代测序技术亦有不俗表现[36-37]。尽管前期纳米孔测序技术有错误率较高的状况,尤其是对于一些突变频率较高的未知病毒基因组,但通过对MinION设备、芯片活性孔蛋白、试剂及后续结果数据的算法分析等进一步优化,纳米孔测序技术仍具有巨大的潜力和应用空间;另外,虽然纳米孔测序技术的读长在理论上无限长,但有研究结果表明890±1 932 bp的片段长度是最佳的匹配长度[38],说明目前纳米孔测序技术运用到实际实验及研究时需要根据具体情况(包括后续数据分析的流程)进行摸索和优化。目前多项研究结果都表明,虽然纳米孔测序技术具有广阔的前景和潜在应用价值,但在产品性能和实验条件优化上还有很大的提升空间,尤其是其建库所需的高起始浓度;由于单核苷酸检测的高错误率,下机原始数据的分析亦需要研究人员具有生物信息学背景,也正是由于这点,纳米孔测序技术在优势领域的进一步推广应用受到限制。

目前ONT已推出更高通量的测序设备GridION和PromethION,并致力于开发可在手机上进行测序的、更为小巧轻便的SmidglON测序仪和自动化文库制备的微流控设备VolTRAX,表明纳米孔测序技术在向通量更高、便携性更强、自动化程度更高的方向发展[9]。随着各项流程的简化和优化,纳米孔测序技术将在病毒基因组的检测和研究中扮演着越来越重要的角色。

每种检测技术或诊断方法都有其优、缺点,新方法、新技术的出现也并不代表否定已有的技术方法,越来越多的研究发现,SGS和TGS相结合的检测和研究策略更具优势,应该根据具体的研究目的和临床需求构建适宜的测序方案,善加利用不同方法的技术优势以弥补彼此的缺陷,从而更好地利用新技术以获得新的突破和发现。

参考文献
[1]
Reuter JA, Spacek DV, Snyder MP. High-throughput sequencing technologies[J]. Mol Cell, 2015, 58(4): 586-597. [DOI]
[2]
Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing[J]. Nat Biotechnol, 2008, 26(10): 1135-1145. [DOI]
[3]
Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA[J]. Genomics, 2016, 107(1): 1-8. [DOI]
[4]
van Dijk EL, Jaszczyszyn Y, Naquin D, Thermes C. The third revolution in sequencing technology[J]. Trends Genet, 2018, 34(9): 666-681. [DOI]
[5]
Manrao EA, Derrington IM, Pavlenok M, Niederweis M, Gundlach JH. Nucleotide discrimination with DNA immobilized in the MspA nanopore[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e257223. [DOI]
[6]
Pennisi E. Genome sequencing. Search for pore-fection[J]. Science, 2012, 336(6081): 534-537. [DOI]
[7]
Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing[J]. Nat Biotechnol, 2016, 34(5): 518-524. [DOI]
[8]
Jain M, Koren S, Miga KH, Quick J, Rand AC, Sasani TA, Tyson JR, Beggs AD, Dilthey AT, Fiddes IT, Malla S, Marriott H, Nieto T, O'Grady J, Olsen HE, Pedersen BS, Rhie A, Richardson H, Quinlan AR, Snutch TP, Tee L, Paten B, Phillippy AM, Simpson JT, Loman NJ, Loose M. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads[J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(4): 338-345. [DOI]
[9]
王佶, 马学军. 纳米孔测序技术在病毒基因组研究中的应用[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2018, 32(2): 214-219. [DOI]
[10]
Johnson SS, Zaikova E, Goerlitz DS, Bai Y, Tighe SW. Real-time DNA sequencing in the Antarctic Dry Valleys using the Oxford Nanopore Sequencer[J]. J Biomol Tech, 2017, 28(1): 2-7. [DOI]
[11]
Castro-Wallace SL, Chiu CY, John KK, Stahl SE, Rubins KH, McIntyre ABR, Dworkin JP, Lupisella ML, Smith DJ, Botkin DJ, Stephenson TA, Juul S, Turner DJ, Izquierdo F, Federman S, Stryke D, Somasekar S, Alexander N, Yu G, Mason CE, Burton AS. Nanopore DNA sequencing and genome assembly on the international space station[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 18022. [DOI]
[12]
Kilianski A, Haas JL, Corriveau EJ, Liem AT, Willis KL, Kadavy DR, Rosenzweig CN, Minot SS. Bacterial and viral identification and differentiation by amplicon sequencing on the MinION nanopore sequencer [J/OL]. Gigascience, 2015, 4: 12.https://academic.oup.com/gigascience/article/4/1/s13742-015-0051-z/2707537.
[13]
Harel N, Me ir, M, Gophna U, Stern A. Direct sequencing of RNA with MinION nanopore: detecting mutations based on associations[J]. Nucleic Acids Res, 2019, 47(22): e148. [DOI]
[14]
Quick J, Loman NJ, Duraffour S, Simpson JT, Severi E, Cowley L, Bore JA, Koundouno R, Dudas G, Mikhail A, Ouédraogo N, Afrough B, Bah A, Baum JH, Becker-Ziaja B, Boettcher JP, Cabeza-Cabrerizo M, Camino-Sanchez A, Carter LL, Doerrbecker J, Enkirch T, Dorival IGG, Hetzelt N, Hinzmann J, Holm T, Kafetzopoulou LE, Koropogui M, Kosgey A, Kuisma E, Logue CH, Mazzarelli A, Meisel S, Mertens M, Michel J, Ngabo D, Nitzsche K, Pallash E, Patrono LV, Portmann J, Repits JG, Rickett NY, Sachse A, Singethan K, Vitoriano I, Yemanaberhan RL, Zekeng EG, Trina R, Bello A, Sall AA, Faye O, Faye O, Magassouba N, Williams CV, Amburgey V, Winona L, Davis E, Gerlach J, Washington F, Monteil V, Jourdain M, Bererd M, Camara A, Somlare H, Camara A, Gerard M, Bado G, Baillet B, Delaune D, Nebie KY, Diarra A, Savane Y, Pallawo RB, Gutierrez GJ, Milhano N, Roger I, Williams CJ, Yattara F, Lewandowski K, Taylor J, Rachwal P, Turner D, Pollakis G, Hiscox JA, Matthews DA, O'Shea MK, Johnston AM, Wilson D, Hutley E, Smit E, Di Caro A, Woelfel R, Stoecker K, Fleischmann E, Gabriel M, Weller SA, Koivogui L, Diallo B, Keita S, Rambaut A, Formenty P, Gunther S, Carroll MW. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance[J]. Nature, 2016, 530(7589): 228-232. [DOI]
[15]
Hoenen T, Groseth A, Rosenke K, Fischer RJ, Hoenen A, Judson SD, Martellaro C, Falzarano D, Marzi A, Squires RB, Wollenberg KR, de Wit E, Prescott J, Safronetz D, van Doremalen N, Bushmaker T, Feldmann F, McNally K, Bolay FK, Fields B, Sealy T, Rayfield M, Nichol ST, Zoon KC, Massaquoi M, Munster VJ, Feldmann H. Nanopore sequencing as a rapidly deployable Ebola outbreak tool[J]. Emerg Infect Dis, 2016, 22(2): 331-334. [URI]
[16]
Quick J, Grubaugh ND, Pullan ST, Claro IM, Smith AD, Gangavarapu K, Oliveira G, Robles-Sikisaka R, Rogers TF, Beutler NA, Burton DR, Lewis-Ximenez LL, de Jesus JG, Giovanetti M, Hill SC, Black A, Bedford T, Carroll MW, Nunes M, Alcantara LC Jr, Sabino EC, Baylis SA, Faria NR, Loose M, Simpson JT, Pybus OG, Andersen KG, Loman NJ. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples[J]. Nat Protoc, 2017, 12(6): 1261-1276. [DOI]
[17]
Faria NR, Sabino EC, Nunes MR, Alcantara LC, Loman NJ, Pybus OG. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil[J]. Genome Med, 2016, 8(1): 97. [DOI]
[18]
Hansen S, Faye O, Sanabani SS, Faye M, Böhlken-Fascher S, Faye O, Sall AA, Bekaert M, Weidmann M, Czerny CP, Abd El Wahed A. Combination random isothermal amplification and nanopore sequencing for rapid identification of the causative agent of an outbreak[J]. J Clin Virol, 2018, 106: 23-27. [DOI]
[19]
Wang J, Moore NE, Deng YM, Eccles DA, Hall RJ. MinION nanopore sequencing of an influenza genome[J]. Front Microbiol, 2015, 6: 766. [DOI]
[20]
Butt SL, Taylor TL, Volkening JD, Dimitrov KM, Williams-Coplin D, Lahmers KK, Miller PJ, Rana AM, Suarez DL, Afonso CL, Stanton JB. Rapid virulence prediction and identification of Newcastle disease virus genotypes using third-generation sequencing[J]. Virol J, 2018, 15(1): 179. [DOI]
[21]
Karamitros T, van Wilgenburg B, Wills M, Klenerman P, Magiorkinis G. Nanopore sequencing and full genome de novo assembly of human cytomegalovirus TB40/E reveals clonal diversity and structural variations[J]. BMC Genomics, 2018, 19(1): 577. [DOI]
[22]
Hansen S, Dill V, Shalaby MA, Eschbaumer M, Böhlken-Fascher S, Hoffmann B, Czerny CP, Abd El Wahed A. Serotyping of foot-and-mouth disease virus using oxford nanopore sequencing[J]. J Virol Methods, 2019, 263: 50-53. [DOI]
[23]
Simpson JT, Workman RE, Zuzarte PC, David M, Dursi LJ, Timp W. Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing[J]. Nat Methods, 2017, 14(4): 407-410. [DOI]
[24]
Lim A, Naidenov B, Bates H, Willyerd K, Snider T, Couger MB, Chen C, Ramachandran A. Nanopore ultra-long read sequencing technology for antimicrobial resistance detection in Mannheimia haemolytica[J]. J Microbiol Methods, 2019, 159: 138-147. [DOI]
[25]
Batovska J, Lynch SE, Rodoni BC, Sawbridge TI, Cogan NO. Metagenomic arbovirus detection using MinION nanopore sequencing[J]. J Virol Methods, 2017, 249: 79-84. [DOI]
[26]
Greninger AL, Naccache SN, Federman S, Yu G, Mbala P, Bres V, Stryke D, Bouquet J, Somasekar S, Linnen JM, Dodd R, Mulembakani P, Schneider BS, Muyembe-Tamfum JJ, Stramer SL, Chiu CY. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis[J]. Genome Med, 2015, 7: 99. [DOI]
[27]
Kafetzopoulou LE, Efthymiadis K, Lewandowski K, Crook A, Carter D, Osborne J, Aarons E, Hewson R, Hiscox JA, Carroll MW, Vipond R, Pullan ST. Assessment of metagenomic Nanopore and Illumina sequencing for recovering whole genome sequences of chikungunya and dengue viruses directly from clinical samples [J/OL]. Euro Surveill, 2018, 23(50). https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2018.23.50.1800228.
[28]
Russell JA, Campos B, Stone J, Blosser EM, Burkett-Cadena N, Jacobs JL. Unbiased strain-typing of arbovirus directly from mosquitoes using Nanopore sequencing: a field-forward biosurveillance protocol[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 5417. [DOI]
[29]
Keller MW, Rambo-Martin BL, Wilson MM, Ridenour CA, Shepard SS, Stark TJ, Neuhaus EB, Dugan VG, Wentworth DE, Barnes JR. Direct RNA sequencing of the coding complete influenza A virus genome[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 14408. [DOI]
[30]
Wongsurawat T, Jenjaroenpun P, Taylor MK, Lee J, Tolardo AL, Parvathareddy J, Kandel S, Wadley TD, Kaewnapan B, Athipanyasilp N, Skidmore A, Chung D, Chaimayo C, Whitt M, Kantakamalakul W, Sutthent R, Horthongkham N, Ussery DW, Jonsson CB, Nookaew I. Rapid sequencing of multiple RNA viruses in their native form[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 260. [DOI]
[31]
Boldogk Ao″ i Z, Moldován N, Balázs Z, Snyder M, Tombácz D. Long-read sequencing-a powerful tool in viral transcriptome research[J]. Trends Microbiol, 2019, 27(7): 578-592. [DOI]
[32]
Kafetzopoulou LE, Pullan ST, Lemey P, Suchard MA Ehichioya DU, Pahlmann M, Thielebein A, Hinzmann J, Oestereich L, Wozniak DM, Efthymiadis K, Schachten D, Koenig F, Matjeschk J, Lorenzen S, Lumley S, Ighodalo Y, Adomeh DI, Olokor T, Omomoh E, Omiunu R, Agbukor J, Ebo B, Aiyepada J, Ebhodaghe P, Osiemi B, Ehikhametalor S, Akhilomen P, Airende M, Esumeh R, Muoebonam E, Giwa R, Ekanem A, Igenegbale G, Odigie G, Okonofua G, Enigbe R, Oyakhilome J, Yerumoh EO, Odia I, Aire C, Okonofua M, Atafo R, Tobin E, Asogun D, Akpede N, Okokhere PO, Rafiu MO, Iraoyah KO, Iruolagbe CO, Akhideno P, Erameh C, Akpede G, Isibor E, Naidoo D, Hewson R, Hiscox JA, Vipond R, Carroll MW, Ihekweazu C, Formenty P, Okogbenin S, Ogbaini-Emovon E, Günther S, Duraffour S. Metagenomic sequencing at the epicenter of the Nigeria 2018 Lassa fever outbreak[J]. Science, 2019, 363(6422): 74-77. [DOI]
[33]
Depledge DP, Srinivas KP, Sadaoka T, Bready D, Mori Y, Placantonakis DG, Mohr I, Wilson AC. Direct RNA sequencing on nanopore arrays redefines the transcriptional complexity of a viral pathogen[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 754. [DOI]
[34]
Viehweger A, Krautwurst S, Lamkiewicz K, Madhugiri R, Ziebuhr J, Hölzer M, Marz M. Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis[J]. Genome Res, 2019, 29(9): 1545-1554. [DOI]
[35]
Callaway E. Flu virus finally sequenced in its native form[J]. Nature, 2018, 556(7702): 420. [DOI]
[36]
Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W; China Novel Coronavirus Investigating and Research Team. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019[J]. N Engl J Med, 2020, 382(8): 727-733. [DOI]
[37]
Chan JF, Yuan S, Kok KH, To KK, Chu H, Yang J, Xing F, Liu J, Yip CC, Poon RW, Tsoi HW, Lo SK, Chan KH, Poon VK, Chan WM, Ip JD, Cai JP, Cheng VC, Chen H, Hui CK, Yuen KY. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster[J]. Lancet, 2020, 395(10223): 514-523. [DOI]
[38]
Mikheyev AS, Tin MM. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer[J]. Mol Ecol Resour, 2014, 14(6): 1097-1102. [DOI]

文章信息

崔晓娴, 李云逸, 杨玉颖, 张曦, 李崇山
CUI Xiaoxian, LI Yunyi, YANG Yuying, ZHANG Xi, LI Chongshan
纳米孔测序技术在病毒性传染病检测及研究中的应用
Application of nanopore sequencing technology in detection and study of viral infectious diseases
微生物与感染, 2020, 15(3): 179-185.
Journal of Microbes and Infections, 2020, 15(3): 179-185.
通信作者
李崇山
E-mail:lichongshan@scdc.sh.cn
基金项目
上海市卫生健康委员会科研课题(201940311)

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