非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指分枝杆菌属中除结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)及麻风分枝杆菌以外其他分枝杆菌的统称，广泛存在于环境中，可造成人类的机会性感染^[1]。NTM主要侵犯患者肺部，也常累及淋巴结、骨骼、关节、皮肤、软组织等，严重时还可引起全身播散性疾病^[2]。近年来，受气候、环境、检测手段、人口老龄化、免疫抑制宿主增多等因素影响，全球NTM感染呈快速增多趋势^[3-4]。临床上，NTM的早期诊断较为困难^[5]，参照《2012年中国非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识》(以下简称《中国专家共识》)^[2]，NTM肺病的诊断需结合临床症状、影像学标准及分枝杆菌培养结果。本研究纳入了确诊与疑似NTM肺病患者共90例，利用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)对临床分离的NTM菌株进行菌种鉴定，并回顾性分析NTM肺病的菌种分布及其临床特征，以期为NTM肺病的诊治提供参考。

1 资料与方法 1.1 资料来源

参照《中国专家共识》^[2]，回顾性收集2017年5月—2018年10月复旦大学附属中山医院确诊及疑似NTM肺病患者的临床资料，包括临床表现、实验室检查、影像学资料及诊治随访情况等。确诊与疑似患者均满足《中国专家共识》中诊断标准^[2]，且已排除菌株定植与其他疾病的可能。共收集患者90例，其中确诊67例、疑似23例。所有菌株来源于本院微生物实验室，所有患者临床资料来源于本院住院以及门诊病案登记。

1.2 分枝杆菌的培养及菌种鉴定

分枝杆菌培养采用快速全自动分枝杆菌培养和药物敏感检测系统〔BACTEC MGIT960 System(美国BD公司)〕或改良罗氏培养法。MTBC与NTM的初步鉴定采用MPB64免疫胶体金快速诊断试剂盒(杭州创新生物有限公司)。NTM菌种鉴定使用VITEK MS分枝杆菌/奴卡菌试剂盒〔梅里埃诊断产品(上海)有限公司，货号：415659〕，利用VITEK质谱仪〔梅里埃诊断产品(上海)有限公司〕，应用MALDI-TOF MS技术^[6]鉴定至菌种或复合群水平。具体操作方法：①在装有适量直径为0.5 mm玻璃珠的2 mL EP管中加入500 μL70%乙醇，添加1满环1 μL接种环量的菌落；②振荡5 min，室温放置10 min，将悬液转入空的EP管(注意不要吸到玻璃珠)；③10 000 rpm离心2 min；④用吸管小心移去所有上清液，尽量吸干乙醇；⑤添加10 μL的70%甲酸，涡旋振荡混匀，室温孵育15 min；⑥添加10 μL的乙腈，涡旋振荡混匀；⑦10 000 rpm离心2 min；⑧用1 μL上清液涂布靶板，完全干燥后，加1 μL质谱样本处理基质液〔梅里埃诊断产品(上海)有限公司，货号：411071〕，风干后上机检测。

1.3 NTM分类标准

NTM根据生长速度可分为快速生长分枝杆菌(3~7 d内在固体培养基上生长，肉眼可见菌落)，包含偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum，M. fortuitum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus, M.abscessus)、产黏液分枝杆菌(Mycobacterium mucogenicum，M.mucogenicum)等；以及慢速生长分枝杆菌(7 d以上在固体培养基上可见菌落)，包含堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii, M.kansasii)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae, M.gordonae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare, M.intracellulare)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium，M.avium)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi，M. xenopi)、慢生黄分枝杆菌(Mycobacterium lentiflavum，M.lentiflavum)等^[7-8]。

1.4 患者临床特征分析

对收集的90例患者的一般情况、临床症状、影像学表现、诊治随访情况等临床资料进行分析，比较确诊和疑似NTM肺病及不同菌种NTM肺病患者的临床特点。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0对数据进行分析。正态计量资料采用x±s表示，两组正态计量资料比较采用独立样本t检验；非正态计量资料采用M(P25，P75)表示，两组非正态计量资料比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料比较采用Pearson卡方检验或Fisher确切概率法。P < 0.05表明差异有统计学意义。

2 结果 2.1 确诊与疑似NTM肺病患者的菌种构成

本研究共纳入2017年5月—2018年10月本院有完整临床资料(包括详细病史以及影像学资料)的确诊及疑似NTM肺病患者90例，其中确诊患者67例、疑似患者23例。菌种分布情况见表 1，NTM菌种鉴定为9种，其中慢速生长分枝杆菌共65例(72.2%)，以胞内分枝杆菌占多数(54.4%，49/90)；快速生长分枝杆菌共25例(27.8%)，以脓肿分枝杆菌占多数(22.2%，20/90)。确诊和疑似患者相比，NTM菌种构成比存在显著差异(P=0.002)，确诊患者中胞内分枝杆菌所占比例更高(61.2% vs 34.8%，P=0.032)，除胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌以外，其他少见菌种所占比例较低(6.0% vs 26.1%，P=0.016)。

2.2 确诊与疑似NTM肺病患者的临床特征比较

确诊与疑似患者在一般情况、临床症状、影像学表现、诊治随访情况等方面的临床特点比较见表 2。67例确诊患者中位起病年龄58.0岁(48.0~65.0)，男29例(43.3%，29/67)，女38例(56.7%，38/67)。症状以咳嗽(83.6%，56/67)、咳痰(80.6%，54/67)、发热(47.8%，32/67)等为主。确诊患者中，50例(74.6%，50/67)影像学表现存在支气管扩张，2例可确定NTM感染发生先于支气管扩张，6例可确定支气管扩张发生先于NTM感染，其余42例患者NTM感染与支气管扩张的先后关系无法明确。确诊与疑似患者在临床表现方面未发现显著差异。与疑似患者相比，确诊患者中有抗NTM治疗史的比例显著高于疑似患者(85.1% vs 4.3%，P < 0.001)。

2.3 快速生长组患者抗MTBC治疗史的比例显著高于慢速生长组

67例确诊患者中分离出慢速生长NTM 50例(74.6%，50/67)，快速生长NTM 17例(25.4%，17/67)。两组在起病年龄、性别、症状、影像学表现等方面未见显著差异。快速生长组患者既往抗MTBC治疗史的比例显著高于慢速生长组(52.9% vs 24.0%，P=0.036)。不同菌种NTM肺病的临床特点比较见表 3。

3 讨论

本研究评估了上海一所综合性三级甲等医院中NTM肺病临床分离株的菌种分布及临床特征。在90例标本中NTM菌种鉴定为9种，其中慢速生长分枝杆菌65例(72.2%)，以胞内分枝杆菌占多数(54.4%，49/90)；快速生长分枝杆菌25例(27.8%)，以脓肿分枝杆菌占多数(22.2%，20/90)，这与我国北京市^[9]、长沙市^[10]、徐州市^[11]、云南省^[12]等地的研究结果相一致。本研究收集的90例患者中，NTM确诊患者67例、疑似患者23例。确诊与疑似患者相比，NTM菌种构成比的差异显著(P=0.002)。确诊患者中胞内分枝杆菌所占比例更高(61.2% vs 34.8%，P=0.032)，除胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌以外，其他少见菌种所占比例较低(6.0% vs 26.1%，P=0.016)。NTM肺病的症状常无特异性，影像学表现有结节、空洞、支气管扩张，通常认为2种或3种表现同时存在，而纵隔、肺门淋巴结肿大与胸腔积液的发生率较低^[13-14]。NTM感染与支气管扩张关系密切^[15]，但先后因果关系目前尚不明确^[16-17]。本研究中确诊患者的影像学表现存在支气管扩张的有50例(74.6%，50/67)，但42例患者NTM感染与支气管扩张的先后关系无法明确，与文献报道的结果相符。NTM诊断需结合临床表现、影像学标准和细菌学标准综合分析。由于痰涂片检测抗酸杆菌阳性率低、培养周期长，因此NTM诊断与鉴别诊断较为困难。本研究中67例确诊患者中分离出慢速生长NTM 50例(74.6%，50/67)、快速生长NTM 17例(25.4%，17/67)，两组在起病年龄、性别、症状、影像学表现等方面未见显著差异。而快速生长组既往抗MTBC治疗史的比例显著高于慢速生长组(52.9% vs 24.0%，P=0.036)，提示快速生长组NTM肺病可能在发病初期较难与MTBC进行鉴别诊断，因此对于常规肺结核治疗期间分离出NTM的疑似患者，临床医生应谨慎判断并长期随访，以免漏诊或误诊。本研究确诊患者中抗NTM治疗史的比例显著高于疑似患者(85.1% vs 4.3%，P < 0.001)，这与《中国专家共识》中不建议对疑似NTM肺病患者进行试验性治疗^[2]相一致。

由于不同NTM肺病的用药种类和疗程有所不同^[2]，仅通过临床表现较难区分不同NTM肺病，因此利用实验室检测进行NTM菌种鉴定对后续治疗起到极其重要的指导作用。本研究利用MALDI-TOF MS对收集的90例NTM肺病患者的标本进行了NTM菌种鉴定，为NTM肺病的诊断和鉴别诊断提供了重要信息。

MALDI-TOF MS的基本原理是通过软电离质谱技术获得微生物蛋白质量指纹图，指纹图谱含有代表某种微生物特定表型或基因型特性的生物标志物信息，通过与已有数据库中的信息比对可对微生物的种属进行归类^[7]。MALDI-TOF MS检测准确率较高，本院既往研究表明，利用MALDI-TOF MS鉴定NTM至复合群水平的准确率可达97.1%^[18]。相比较于传统的生化反应鉴定方法，MALDI-TOF MS所需时间更短，所需样本量更少，检测更为简单，费用更少；与高效液相色谱技术相比，MALDI-TOF MS操作简单快速，耗材成本低，不易受菌株的生长环境、营养状况的影响；与分子诊断技术如DNA测序、DNA杂交等相比，MALDI-TOF MS菌种鉴定范围更广，对技术要求更为简单，价格低廉；目前二代测序技术的发展提高了NTM菌种鉴定的效率，但费用高昂，增加了患者的经济成本^[19-20]。MALDI-TOF MS的局限性在于对混合型感染的菌株鉴定困难，提取率易受操作者经验的影响^[21]。

本文属于回顾性研究，部分菌种样本量较少，进行统计分析时可能存在偏倚。由于样本量限制，可能未发现不同菌种NTM肺病在临床表现上存在的差异。此外，本研究仅纳入上海地区一家综合性三级甲等医院的病例进行分析，然而关于NTM肺病的临床特点分析则需要更多大规模的流行病学调查及多中心的前瞻性研究。

综上所述，本研究对NTM肺病患者的菌种分布和临床特征进行了分析和总结，对比了确诊和疑似NTM肺病及不同菌种NTM肺病患者的临床特征与诊治情况，期望对提高NTM感染的诊断、鉴别诊断和治疗水平有所帮助。