2020, Vol. 15
2. 复旦大学公共卫生学院环境卫生学教研室，上海 200032
2. Department of Environmental Health, School of Public Health, Fudan University, Shanghai 200032, China
2019年12月在我国武汉出现的不明原因肺炎由新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)感染所致[1-4]。随后，2019-nCoV蔓延至全国，截至2020年2月9日，已导致37 289人感染，死亡人数达813人。2019-nCoV主要经呼吸道和接触传播，以聚集性传播尤为严重。呼吸道防护是防控该疾病的关键之一，可减少二次传播的概率。由于疫情持续蔓延，口罩等个人防护用品短缺现象严重。目前，流传许多口罩再生方法，但大多缺乏科研数据，未曾证明灭活病毒的效果，以及灭活病毒处理后对口罩滤过功能的影响。
流行性感冒(简称流感)病毒与2019-nCoV均为有包膜病毒，理化性质相似，且均主要经呼吸道传播。本研究以普通一次性医用口罩为例，用流感病毒作为模型病毒，模拟2019-nCoV污染，采用常用的恒温烘箱干烤和电吹风机热风处理2种方法，对表面污染有流感病毒的一次性医用口罩进行处理，检测热处理对病毒的灭活效果及口罩滤过截留PM2.5效果的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料一次性医用外科口罩(ASTM F2100，等同于YY0469-2011)[5]。某品牌家用电吹风机(50 Hz, 1 400 W)。流感病毒H1N1 A/PR8/34毒株从美国模式培养物集存库(ATCCⓇ VR-95TM)引进；Mardin-Darby狗肾细胞(Mardin-Darby canine kidney cell，MDCK细胞)购自中国科学院上海生命科学研究院，培养基为含5%胎牛血清的DMEM培养基(购自Gibco公司)。TPCK-胰酶购自Sigma公司，病毒采样管购自友康生物科技有限公司。QIAamp Viral RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司(货号：52904)。实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerasechain reaction, 实时荧光qRT-PCR)采用One Step PrimeScript RT-PCR试剂盒(TAKARA公司，RR064A)。
1.2 病毒灭活恒温烘箱干热处理：流感病毒浓缩液3.6×107 pfu/ml，分别取10 μL滴加于口罩防水层(蓝色)表面3个不同位置(病毒操作在生物安全柜中进行)，滴加病毒的口罩置于锡箔纸上，然后放入铝质饭盒，加盖后放入恒温烘箱56 ℃、30 min干热处理。
电吹风热风处理：将滴加有病毒的口罩用保鲜袋包裹，然后在生物安全柜中用电吹风机(最大档)在口罩上方10~20 cm处进行热风处理。
1.3 病毒洗脱及感染 1.3.1 细胞培养将0.25 mL MDCK细胞(4×105细胞/mL)铺板于48孔板中培养。
1.3.2 病毒感染经上述热处理后的口罩，可见病毒滴液斑痕，利用250 μL病毒采样管中的病毒保存液冲吸数次，洗脱病毒至病毒滴液斑痕消失。取125 μL洗脱的病毒悬液并添加5 μ g/mL TPCK-胰酶，接种于细胞中，37 ℃下病毒吸附1 h；然后吸取病毒悬液，用1 mL DMEM培养液洗涤2遍，加入新鲜的1 μ g/mL TPCK-胰酶的DMEM培养液。感染2 d后，观察细胞病变，并收集细胞上清液。
1.4 实时荧光qRT-PCR检测病毒RNA收集140 μL感染细胞的上清液，用QIAamp Viral RNA抽提试剂盒抽提RNA(根据试剂盒说明书操作)。50 μL无RNase的H2O洗脱。取2 μL RNA标本，使用One Step PrimeScript RT-PCR试剂盒，利用引物Yi-js-O-97、Yi-js-O-98及FAM标记的TaqMan荧光探针Yi-js-P-1进行实时荧光qRT-PCR。PCR体系如下：12.5 μL的2×one step RT-PCR缓冲液、0.5 μL的Ex Taq HS、0.5 μL的RT Enzyme、7.0 μL的H2O、0.8 μL的Yi-js-O-97 (10 μ mol/L, 终浓度400 nmol/L)、0.8 μL的Yi-js-O-98 (10 μ mol/L, 终浓度400 nmol/L)、0.4 μL的Yi-js-P-1荧光探针(10 μ mol/L，终浓度200 nmol/L)及2.0 μL RNA样品。反应程序如下：42 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min(同时收集荧光信号)，共40个循环。样本中病毒RNA的相对拷贝数以2-Δ Ct方法进行处理，比值由2-(处理组Ct-未处理组Ct)公式计算得出。各处理方法相对于未处理感染病毒组为对照。
1.5 口罩滤过截留效率的评价采用抽滤瓶(蜀牛，GG-17)和PM2.5监测仪(TSI，AM510)，评估一次性普通医用口罩的烘干处理对其PM2.5滤过截留效果的影响。将口罩分为4组：①洁净组(未使用过的口罩)；②未处理组(口罩正常使用4 h后未作任何处理)；③烘箱处理组(烘箱内56 ℃、30 min干热处理)；④吹风机处理组。将口罩(N=3个/组)严密束缚在抽滤瓶瓶口，使用AM510粉尘仪同时检测口罩正上方和抽滤瓶上嘴出口处的PM2.5浓度，抽滤时间为4 h。每隔30 min记录PM2.5浓度数据，每次重复检测3次。
2 结果 2.1 口罩表面的病毒灭活将一次性医用外科口罩置于锡箔纸上，在口罩蓝色的防水层表面3个不同位置滴加流行性感冒病毒A/PR8悬液(图 1A)，每个位点滴加10 μL(含3.6×105 pfu病毒)。口罩表面的病毒将采用下述2种方法处理(每种方法3个口罩)。①用普通烘箱干烤：将滴加病毒的口罩(下垫锡箔纸)，放入铝盒，加盖后放入普通烘箱，56 ℃ 30 min干热处理(56 ℃、30 min通常为灭活血清等标本中病毒的条件)，见图 1A。干热处理后，口罩表面可见病毒悬液斑痕，由于口罩表面的疏水性，待病毒洗脱后，病毒悬液斑痕溶于洗脱液，〔斑痕消失(图 1A)，口罩表面的疏水性无明显改变(图 1A，向下箭头所指)〕。②用家常用电吹风机热风处理：将滴加有病毒的口罩用保鲜袋包裹，在口罩上方10~20 cm处电吹风机加热吹风(最大档)，电吹风机热风处理1 min 30 s后，风口温度可升至70 ℃，并持续维持在该温度)，热风处理共30 min。口罩先用保鲜袋包裹是因为口罩表面疏水性强，不便于热风处理。为防止吹风将沾染的病原体散布，可将10 μL病毒悬液(含3.6×105 pfu病毒)滴加于口罩的褶皱层中，用保鲜袋包裹，然后加热吹风(图 1B)。30min热风处理后，洗脱滴加于口罩的病毒，发现电吹风机热风处理不影响口罩表面的疏水性(图 1B，向右箭头所指)。
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| A. The left, virus drops was doted onto the surface of medical mask before baking; The Right, after baking, the traces of virus drops was visible and disappeared after virus rescue. B. The left, virus drops was doted onto between the kink marks of mask; The Right, the mask was wrapped with a food storage bag and then heat treated with hair dryer by moving around over the surface of the wrapped mask vertically at a distance of about 10~20 cm. The virus was rescued as described above. 图 1 口罩的病毒灭活实验设计 Fig. 1 Design of the heat inactivation of medical mask |
将滴加于口罩上并经灭活方法处理的流感病毒A/PR8洗脱后感染MDCK细胞，观察细胞病变及测定细胞上清液中的病毒基因组拷贝数，分别评价烘箱干烤和电吹风机热风处理灭活病毒的效果。未经灭活处理组的病毒洗脱液接种至MDCK细胞后，细胞出现明显病变；但经烘箱干烤和电吹风机热风处理，洗脱液接种的细胞均未出现明显的细胞病变(图 2A)。
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| A.CPE of infected MDCK cells. B. Relative RNA copies of IVA RNA. 图 2 病毒灭活效果评价 Fig. 2 Infectivity of the rescued virus after hair dryer treatment |
收集感染细胞上清液，提取RNA，利用实时荧光qRT-PCR检测病毒基因组拷贝数。电吹风机30 min热风处理组的感染细胞上清液中病毒拷贝数降低至原来的1/1 000 000~1/10 000 000，接近未感染组水平。然而，烘箱干热处理组感染细胞上清液中的病毒拷贝数降低至原来的1/10~1/100，但仍高于未感染组(图 2B)，提示病毒未被充分灭活。
2.3 热处理后口罩滤过截留效率不变为探讨经烘箱干烤和电吹风机热风处理对口罩的滤过截留效率的影响，进一步检测了处理后的口罩滤过截留PM2.5的效果(图 3A)。将口罩分为4组：①洁净组(未使用的口罩)；②未处理组(口罩正常使用4h后未作任何处理)；③烘箱干热处理组(烘箱内56 ℃、30 min干热处理)；④吹风机热风处理组。将口罩(N=3个/组)严密束缚在抽滤瓶瓶口，使用AM510粉尘仪同时检测口罩正上方和抽滤瓶上嘴出口处的PM2.5浓度，抽滤时间为4 h，每隔30 min记录PM2.5浓度数据。
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| A. Experiment set up. B. PM2.5 filtration rate change during the 4-hour suction process. C. Average PM2.5 filtration rate within the suction process. 图 3 口罩滤过截留效果评价 Fig. 3 PM2.5 filterability of medical masks after heart treatment |
从图 3B中可见，4组口罩的PM2.5滤过截留效果随抽滤时间的改变而有所变化，但其改变均不显著。其中，洁净口罩的PM2.5滤过截留效率随抽滤时间的增长而略微降低；电吹风机热风处理已使用的口罩PM2.5滤过截留效率随抽滤时间的增长略有提升，但不显著；另外2组(未处理组和烘箱干烤处理组)PM2.5滤过效率在4 h的抽滤过程中略有波动, 但基本保持稳定。如图 3C所示，4 h内口罩的平均PM2.5滤过效率表明，使用前、后的口罩滤过截留PM2.5的效率基本无变化，而烘箱干热或电吹风机热风处理后的口罩PM2.5滤过截留效率也基本无改变，整体维持在85%左右。结果提示，烘箱或电吹风机热处理基本不会影响普通一次性医用口罩滤过截留大气细颗粒物的效率。
3 讨论个人防护用品在灭活其表面潜在的病毒后再生利用可以节省资源，减少二次传播。2006年我国台湾地区行政院劳工安全卫生研究所曾对N95等几种口罩的重复利用做过报道，认为70 ℃ 30 min干热及250 nm紫外线照射可杀灭大肠埃希菌而不损坏口罩本身，其可被重复利用(https://labor-elearning. mol.gov.tw/co_report_detail.php?rid=115)。报道发现，有机溶剂，如酒精、湿热等均会损伤滤膜，不宜使用。最近，北京大学报道了用微波炉处理再生口罩的实验(https://www.sohu.com/a/370944754_803988)，但考虑到有些口罩含有金属条，处理前需先去除口罩的金属丝，处理后再将金属丝复位。此外，各种报道的口罩再生方法是否影响滤过截留功能以及对病毒的灭活效果有待实验验证。
再生一次性医用口罩的方法还需考虑以下方面的因素：既不能影响过滤效率，还必须去除其可能沾染的病原体，且尽可能方便操作。医用外科口罩由3部分组成，从外到内分别由蓝色的防水层、中间的过滤层及白色的无纺布舒适层。为评价口罩经热处理对其过滤效率的影响，首先，我们测试了处理前、后口罩对PM2.5的滤过截留效果。由于医用外科口罩并不能阻挡纳米级的病毒，采用了PM2.5的滤过截留效果作为参考。结果未观察到热处理对口罩PM2.5滤过截留效果产生影响。由于用过的医用外科口罩上可能沾有病原体，为了模拟2019-nCoV，我们依据流感病毒与其都有包膜等相似理化性质，以污染有流感病毒的医用外科口罩作为模型，用常用的热灭活方式(烘箱内56 ℃、30 min干热处理和比较有普及性及简便的家用电吹风机30 min热风处理)，评价2种热处理对病毒的灭活效果。结果显示, 电吹风机30 min热风处理后病毒拷贝数降低至原来的1/1 000 000~1/10 000 000，接近未感染水平。由于本研究中使用了高剂量的病毒悬液，电吹风机30 min热风处理后仍然检测到病毒RNA，可能为感染后未完全洗涤干净的病毒残留(我们认为病毒已全部灭活)。但烘箱56 ℃ 30 min干热处理仅降低病毒拷贝数至原来的1/10~1/100，显示未能完全灭活病毒(图 2B)。处于生物安全考虑，我们进行烘箱干热处理时，口罩置于封闭铝质饭盒内，可能会影响饭盒内口罩表面的实际温度。适当延长干烤时间可能有更好的效果，或口罩如直接放置于烘箱内可能效果更佳。因此提示，用干热灭活病原体时需要考虑热灭活的穿透性能。
为解决当前普通医用口罩短缺的问题，课题组通过滤过截留及病毒灭活实验，检验了用热处理进行普通医用口罩的再生利用，将用过的口罩用保鲜袋包裹(防止吹风将沾染的病原体散布)，用家用简便电吹风机30 min热风处理即可安全、有效地再生医用外科口罩。目前我们尚未测试一次性医用外科口罩最多可再生几次，有关研究正在进行中。
然而，值得指出的是：在口罩匮乏的非常时期，普通人群可采用该简便技术再生口罩后再次使用，但该方法再生的口罩不适合密切接触患者的人群、医护人员及实验室工作人员使用。
致谢
感谢实验参与人员在短期内完成上述工作，感谢闻玉梅院士给予的指导！
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