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  微生物与感染  2020, Vol. 15 Issue (4): 228-232      DOI: 10.3969/j.issn.1673-6184.2020.04.005
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2型IgM/IgG、病毒核酸和白细胞介素6的联合检测在2019冠状病毒病诊断和治疗中的价值
薛晓婕 , 陈美周 , 张常亮 , 汪宏良     
湖北省黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院检验科), 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室, 黄石 435001
摘要:探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)/免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)、病毒核酸和白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)的联合检测在2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019, COVID-19)诊断和治疗中的临床价值。本研究按照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》的标准收集了93例确诊病例(51例危重型、18例重型,15例轻型和9例普通型)和20例疑似病例(核酸检测阴性但临床症状和CT检测结果均符合标准)。选取110例儿科、妇科、肿瘤、血液和消化等疾病患者并排除COVID-19作为对照组。采用全自动化学发光免疫分析技术和电化学发光技术检测所有研究对象血清中SARS-CoV-2 IgM/IgG和IL-6。用实时荧光定量反转录聚合酶链反应对病例组和对照组的咽拭子进行SARS-CoV-2核酸检测。结果发现,血清IgM、IgG和IL-6在疑似病例中的阳性率分别为85%、75%和0%,在确诊病例中的阳性率分别为98.9%、95.7%和75.2%(其中危重型分别为100%、100%和100%,重型分别为94.4%、100%和97.9%,轻型分别为100%、93.3%和5%、普通型分别为100%、66.7%和0%)。IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG表达水平的改变与患者疾病的严重程度存在一定的关联性,差异有统计学意义(χ2=273.51,χ2=149.37;P<0.05)。血清IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG的联合检测可作为诊断和治疗COVID-19的监测指标,也可作为SARS-CoV-2核酸检测假阴性的有效互补。
关键词严重急性呼吸综合征冠状病毒2型    免疫球蛋白M    免疫球蛋白G    白细胞介素6    核酸    2019冠状病毒病    
The value of combined detection of new coronavirus IgM/IgG, nucleic acids and interleukin 6 in the diagnosis and treatment of new coronavirus disease
XUE Xiaojie , CHEN Meizhou , ZHANG Changliang , WANG Hongliang     
Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University, Huangshi Central Hospital, Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention, Huangshi 435000, Hubei Province, China
Abstract: This article aims to explore the combined detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) immunoglobulin M (IgM)/immunoglobulin G (IgG), viral nucleic acid and interleukin 6 (IL-6) in the diagnosis and treatment of coronavirus disease in 2019 (COVID-19). This study collected 93 patients (51 critical, 18 severe, 15 mild and 9 normal) according to the standard of "New Coronavirus Pneumonia Diagnosis and Treatment Plan (Version 7)" and 20 suspected cases (negative nucleic acid test but clinical symptoms and Ct test results met the standards). 110 patients with other diseases such as pediatrics, gynecology, tumors, blood and digestion illness were selected as the control group. Automatic chemiluminescence immunoassay technology and electrochemiluminescence technology was used to detect 2019-nCoV IgM/IgG and IL-6 in the serum of all subjects. Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect SARS-CoV-2 nucleic acid in pharyngeal swabs of case group and control group. The results showed that the positive rates of serum IgM, IgG and IL-6 in suspected cases were 85%, 75% and 0%, respectively, and the positive rates in patients diagnosed with 2019 coronavirus were 98.9%, 95.7% and 75.2%, respectively (Among them, critical cases are 100%, 100% and 100%, severe cases are 94.4%, 100% and 97.9%, mild cases are 100%, 93.3% and 5%, and common types are 100%, 66.7% and 0%). The changes of IL-6 and 2019-nCoV IgM/IgG expression levels were related to the severity of the patients' disease, and the differences were statistically significant (χ2=273.51, χ2=149.37; P < 0.05). The combined detection of serum IL-6 and 2019-nCoV IgM/IgG can be used as a monitoring indicator for the diagnosis and treatment of new coronavirus infection, and can also be used as an effective complement to the false negative detection of SARS-CoV-2 nucleic acid.
Keywords: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2    Immunoglobulin M    Immunoglobulin G    Interleukin 6    Nucleic acid    Coronavirus disease 2019    

2020年2月21日国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎防控方案(试行第五版)》指出,根据流行病学和病原学检测研究发现,新出现的病毒性肺炎〔世界卫生组织正式将其命名为2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019, COVID-19)〕由新型冠状病毒〔国际病毒分类委员会正式将其命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)〕引起[1-4],该病毒能发生人际传播[5-6]。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[7]已明确,核酸检测是临床病原学确诊的唯一方法。

但由于病毒在人体中的多样性,不同时段的检出率不同,如何确诊核酸阴性而临床表现和影像学检查均符合诊断要求的患者?如何通过实验室相关检测指标提示疾病的转归?这些都是目前急需解决的问题。IgM是人体免疫系统最先产生的特异性抗体,提示近期有过感染,可用于早期诊断; IgG具有血中含量高、维持时间长、亲和力高等特点,当机体再次受感染时能迅速产生; 白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)是炎症感染指标。本研究拟通过对SARS-CoV-2核酸、患者血清中IgM/IgG和IL-6的联合检测来评估其在SARS-CoV-2感染的诊治和预后中的价值。

1 资料 1.1 病例纳入标准和排除标准

收集2020年1月29日—2月28日在鄂东医疗集团就诊的门诊和住院患者113例作为病例组,其中男性67例、女性46例,年龄3~87岁。病例组中93例为COVID-19确诊病例(核酸检测阳性),20例为疑似病例(核酸检测阴性但临床症状和CT检测结果均符合)。确诊病例中51例危重型,18例重型,15例轻型和9例普通型。选取来自儿科、妇科、肿瘤科、血液科和消化科等科室并排除COVID-19的患者110例作为对照组。其中男性54例、女性56例,年龄0.2~89岁。病人样本的采集时间以起病至抗体采集的时间来计算。本研究遵守国际协调理事会临床试验规范和《赫尔辛基宣言》,经医院伦理审查委员会审核通过(伦理号:WDRY2020-K30)并批准予以豁免患者知情同意。

2 方法 2.1 试剂与仪器

SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体化学发光检测试剂盒(深圳亚辉龙生物科技股份有限公司),IL-6电化学发光检测试剂盒(瑞士Roche公司),新型冠状病毒核酸检测试剂盒(广东达安基因公司)。所用仪器:iFlash3000全自动化学发光免疫分析仪(深圳亚辉龙生物科技股份有限公司),CobasE602全自动电化学发光分析仪(瑞士Roche公司),ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应仪(美国赛默飞公司)。

2.2 标本采集

在发病后3~48 d内采集患者空腹静脉血2~3 mL,置于无抗凝剂的红头真空采血管内,静置待血液凝固,3 000×g离心5 min,取血清备用。采集研究对象的咽拭子标本,进行SARS-CoV-2核酸检测。

2.3 血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6的检测

血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6检测采用化学发光和电化学发光技术,其操作步骤与结果判定均严格按试剂盒说明书要求进行。SARS-CoV-2 IgM或IgG的测试结果以相对发光强度(relative light unit,RLU)表示,检测结果10.0 AU/mL为有反应性(阳性); IL-6以检测结果7.0 Pg/mL为判读标准。

2.4 SARS-CoV-2核酸检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应,检测SARS-CoV-2基因组中开放读码框(open reading frame,ORF) 1ab和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)基因片段。SARS-CoV-2核酸检测结果判读以靶标ORF1ab和靶标N蛋白同时检出为准,CT值结果<40判定为阳性,≥40判定为阴性。靶标ORF1ab和靶标N蛋白均未检出,则判定为阴性。

2.5 统计学方法

所得数据采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析,经Kolmogorov-Smirnov T检验正态性,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(X±SD)表示,两两比较采用t检验,计数资料以频数(百分比)表示,组间比较采用卡方检验,检验水准:α=0.05。

3 结果 3.1 SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19确诊病例和疑似病例中的阳性检出率较高

血清SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19疑似病例中的阳性率分别为85%和75%,在确诊病例中分别为98.9%和95.7%(其中危重型分别为100%和100%,重型分别为94.4%和100%,轻型分别为100%和93.3%,普通型分别为100%和66.7%),见表 1。结果表明,SARS-CoV-2 IgM和IgG的联合检测在COVID-19患者特别是在核酸阴性的疑似临床病例中具有非常高的检出率,是核酸检测漏检的补充。

表 1 SARS-CoV-2 IgM和IgG在COVID-19确诊病例和疑似病例中的阳性检出率 Tab. 1 The positive detection rate of SARS-CoV-2 IgM and IgG in diagnosed and suspected cases of COVID-19
项目 危重型 重型 轻型 普通型 疑似 合计
SARS-CoV-2 IgM 51(51/51) 17(17/18) 15(15/15) 9(9/9) 17(17/20) 109(109/113)
SARS-CoV-2 IgG 51(51/51) 18(18/18) 14(14/15) 6 (6/9) 15(15/20) 104(104/113)
3.2 SARS-CoV-2 IgM和IgG在对照组的阳性检出率较低

对照组的110例患者选自儿科、妇科、肿瘤科、血液科和消化科等科室并排除了COVID-19,检测其SARS-CoV-2 IgM和IgG。结果显示,3例患者SARS-CoV-2 IgM为弱阳性,2例SARS-CoV-2 IgG阳性。出现假阳性的原因可能与肿瘤、血液科患者存在自身免疫系统疾病、受SSA-60等抗体影响有关。

3.3 SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6指标与COVID-19的病情进展有较强的相关性

113例研究对象在发病后3~48 d内监测其SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6。IL-6阳性率在危重型患者中为100%、在重型患者中为97.9%、在轻型患者中为5%、在普通型患者中为0%。将结果进行比较,经χ2检验,发现COVID-19患者血清中IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG水平的变化与疾病的严重程度存在一定的关联性,差异有统计学意义(χ2=273.51,χ2=149.37;P < 0.05)。结果发现,血清IL-6、SARS-CoV-2 IgM和IgG的联合检测对疾病的好转有提示作用(见表 2表 3)。

表 2 SARS-CoV-2 IgM/IgG和IL-6在COVID-19确诊病例和疑似病例中的检出情况 Tab. 2 The detection of positive and negative results of SARS-CoV-2 IgM/IgG and IL-6 in diagnosed and suspected cases of COVID-19
SARS-CoV-2检测 IL-6检测
阳性(例) 阴性(例) 合计(例)
IgM阳性 85 24 109
IgM阴性 0 4 4
IgG阳性 17 87 104
IgG阴性 0 9 9
表 3 血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6表达水平在COVID-19不同临床分型中的比较 Tab. 3 Comparison of serum expression levels of SARS-CoV-2 IgM, IgG and IL-6 in different clinical types of COVID-19
组别 SARS-CoV-2IgM(AU/mL) SARS-CoV-2IgG(AU/mL) IL-6(pg/mL) 发病到采集的时间(d)
危重型 617.2±4.9 16.7±5.2 115.2±7.9 15(3~38)
重型 381.3±9.1 25.4±3.1 80.4±3.6 17(3~45)
轻型 67.1±5.3 56.9±3.7 16.8±2.2 17(3~45)
普通型 30.7±4.6 66.1±2.9 5.7±1.8 17(3~45)
疑似 18.4±2.5 11.3±3.3 3.2±0.8 17(3~45)
4 讨论

SARS-CoV-2是一种正链单股RNA冠状病毒,基因组与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不完全相同。在分类上与SARS-CoV相似,同为β属冠状病毒B亚群(sarbecovirus亚属)[8-11]。由于SARS-CoV-2感染具有较强的隐匿性,潜伏期长,临床表现不一,根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)》规定,只有临床表现+影像学+病原学核酸检测阳性才能够确诊[7, 12]。因此,如何确诊核酸检测阴性而影像学诊断阳性、临床表现符合标准的COVID-19疑似病例给我们提出了一个巨大的挑战。核酸标本检测的准确性受到样本采集与存放、病毒感染的部位、RNA的提取方法以及核酸检测试剂盒的质量问题等多方面因素的影响[13-14],而血清或血浆标本的采集和保存简单、易行,且抗体在血清标本中的稳定性很好。病毒感染存在潜伏期,一般情况下,特异性IgM在发病后5~7 d出现,特异性IgG在发病后10~15 d出现。

本研究运用SARS-CoV-2 IgM和IgG免疫检测试剂盒对血清样本进行SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6的联合检测。研究发现,血清SARS-CoV-2 IgM、IgG和IL-6在疑似病例中的检出率分别为85%、75%和0%,在COVID-19确诊病例中的阳性率分别为98.9%、95.7%和75.2%(其中危重型分别为100%、100%和100%,重型分别为94.4%、100%和97.9%,轻型分别为100%、93.3%和5%,普通型分别为100%、66.7%和0%)。结果提示,SARS-CoV-2 IgM和IgG联合检测在COVID-19患者特别是在核酸阴性的疑似临床病例中具有非常高的检出率。核酸阴性但IgM和IgG阳性提示患者可能近期曾感染SARS-CoV-2并处于恢复期,体内病毒被清除,IgM尚未减低至检测下限; 或提示核酸检测结果假阴性,患者处于感染活跃期。因此,血清SARS-CoV-2特异性抗体检测与病毒核酸检测可为良好互补,前者可协同核酸检测,用于辅助诊断和快速筛查,其结果与相关研究相一致[15]。但SARS-CoV-2 IgM和IgG也会出现假阳性,这可能与体内存在自身抗体、嗜异性抗体等有关:当患有某些基础疾病或免疫功能异常或长期服用某种药物时,机体可产生异常蛋白抗体或特殊物质(如类风湿因子、甲胎蛋白、补体等,均具有一定的非特异性吸附作用)。

在疾病的治疗过程中,综合分析患者的病症及其血常规、D二聚体、血气(分析氧饱和度)等指标发现,随着病情的好转,SARS-CoV-2 IgM水平降低,SARS-CoV-2 IgG水平升高,血清IL-6值降低。病情恶化时,SARS-CoV-2 IgM持续增高,IL-6值也持续增高。研究表明,IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG表达水平的改变与COVID-19患者疾病的严重程度存在一定的关联性,差异有统计学意义(P<0.05)。综上所述,血清IL-6和SARS-CoV-2 IgM/IgG的联合检测既可以作为COVID-19核酸检测假阴性的有效补充,也可作为SARS-CoV-2感染诊断和治疗评价的动态指标。

参考文献
[1]
Chan JF, Yuan S, Kok KH, To KK, Chu H, Yang J, Xing F, Liu J, Yip CC, Poon RW, Tsoi HW, Lo SK, Chan KH, Poon VK, Chan WM, Ip JD, Cai JP, Cheng VC, Chen H, Hui CK, Yuen KY. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster[J]. Lancet, 2020, 395(10223): 514-523. [DOI]
[2]
Wang D, Hu B, Hu C, Zhu F, Liu X, Zhang J, Wang B, Xiang H, Cheng Z, Xiong Y, Zhao Y, Li Y, Wang X, Peng Z. Clinical characteristics of 138 hospitalized patients with 2019 novel coronavirus-infected pneumonia in Wuhan, China[J]. JAMA, 2020, 323(11): 1061-1069. [DOI]
[3]
Chu DKW, Pan Y, Cheng SMS, Hui KPY, Krishnan P, Liu Y, Ng DYM, Wan CKC, Yang P, Wang Q, Peiris M, Poon LLM. Molecular diagnosis of a novel coronavirus (2019-nCoV) causing an outbreak of pneumonia[J]. Clin Chem, 2020, 66(4): 549-555. [DOI]
[4]
国家卫生健康委办公厅.新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)[EB/OL].北京: 国家卫生健康委, 国家中医药管理局办公室, 2020. (2020-02-04). http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-02/05/5474791/files/de44557832ad4be1929091dcbcfca891.pdf.
[5]
Xiao SY, Wu Y, Liu H. Evolving status of the 2019 novel coronavirus infection: proposal of conventional serologic assays for disease diagnosis and infection monitoring[J]. J Med Virol, 2020, 92(5): 464-467. [DOI]
[6]
Wu P, Hao X, Lau EHY, Wong JY, Leung KSM, Wu JT, Cowling BJ, Leung GM. Real-time tentative assessment of the epidemiological characteristics of novel coronavirus infections in Wuhan, China, as at 22 January 2020[J]. Euro Surveill, 2020, 25(3): 2000044. [DOI]
[7]
国家卫生健康委办公厅.新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)[EB/OL].北京: 国家卫生健康委, 国家中医药管理局办公室, 2020: (2020-03-03). http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-03/04/5486705/files/ae61004f930d47598711a0d4cbf874a9.pdf.
[8]
Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si HR, Zhu Y, Li B, Huang CL, Chen HD, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang RD, Liu MQ, Chen Y, Shen XR, Wang X, Zheng XS, Zhao K, Chen QJ, Deng F, Liu LL, Yan B, Zhan FX, Wang YY, Xiao GF, Shi ZL. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 579(7798): 270-273. [DOI]
[9]
Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W, China Novel Coronavirus Investigating and Research Team. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019[J]. N Engl J Med, 2020, 382(8): 727-733. [DOI]
[10]
刘彬, 秦照玲, 戚中田. 新型冠状病毒基因组结构与蛋白功能[J]. 微生物与感染, 2020, 15(1): 52-57. [URI]
[11]
Ceraolo C, Giorgi FM. Genomic variance of the 2019-nCoV coronavirus[J]. J Med Virol, 2020, 92(5): 522-528. [DOI]
[12]
Guan W, Ni Z, Hu Y. Clinical characteristics of 2019 novel coronavirus infection in China[J]. medRxiv, 2020, 2020-2022. [URI]
[13]
里进, 叶光明, 陈良君, 王嘉俊, 李一荣. 新型冠状病毒核酸检测假阴性结果原因分析及对策[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(3): 221-225. [URI]
[14]
莫茜, 秦炜, 傅启华, 关明. 正确认识新冠病毒核酸检测的影响因素[J]. 中华检验医学杂, 2020, 43(3): 213-216. [URI]
[15]
徐万洲, 李娟, 何晓云, 张才庆, 梅四青, 李从荣, 李艳, 程少华, 张平安. 血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(3): 230-233. [URI]

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薛晓婕, 陈美周, 张常亮, 汪宏良
XUE Xiaojie, CHEN Meizhou, ZHANG Changliang, WANG Hongliang
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型IgM/IgG、病毒核酸和白细胞介素6的联合检测在2019冠状病毒病诊断和治疗中的价值
The value of combined detection of new coronavirus IgM/IgG, nucleic acids and interleukin 6 in the diagnosis and treatment of new coronavirus disease
微生物与感染, 2020, 15(4): 228-232.
Journal of Microbes and Infections, 2020, 15(4): 228-232.
通信作者
汪宏良
E-mail:xxj19802003@163.com
基金项目
湖北省卫生健康委联合基金项目(WJ2019H449)、湖北省医学青年拔尖人才计划

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