2020, Vol. 15
2. 上海市血液中心, 上海 200051;
3. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心中医科, 上海 201508
2. Shanghai Blood Center, Shanghai 200051, China;
3. Department of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Public Health Center, FudanUniversity, Shanghai 201508, China
我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的高流行区，乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)携带率约为5%~6%，慢性HBV感染者约7 000万[1]。由于HBV可以经输血传播[2]，2015年, 我国基本实现了核酸检测在血液筛查中的全覆盖，对献血者实施严格的HBsAg和HBV DNA筛查，经输血或血液制品传播HBV的事件已经较少发生[3]。在对献血人群进行核酸检测的过程中，发现了血清HBsAg阴性，但血清和(或)肝组织中HBV DNA阳性的隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)者[3-6]。由于全世界各地区HBV DNA检测手段、病毒流行及人群特征等的差异，目前仍无法得到OBI准确的流行病学及临床特征资料。
本研究通过对选取的HBsAg阴性且HBV DNA阳性及HBsAg阴性且核酸检测阴性的样本进行研究，分析上海地区献血者OBI的HBV血清学特征，并与合格献血者的HBV血清学特征进行比较，从而为OBI的进一步研究提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 研究对象取上海市血液中心2013年1月—2018年12月经核酸检测阳性样本395例，阴性样本523例。所有样本均经2次酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测HBsAg、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗原-抗体结果为阴性，速率法检测丙氨酸氨基转移酶均合格。
1.2 试剂与仪器 1.2.1 试剂HBV-HCV-HIV(1+2型)核酸检测试剂〔cobas@ TaqScreen MPX Test，荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantify polymerase chain reaction，FQ-PCR)〕购自Roche公司，HBV- HCV- HIV(1型)核酸检测试剂〔Procleix Ultrio Plus Assay，转录介导的扩增(transcription-mediated amplification，TMA)技术+化学发光法〕购自GRIFOLS公司(原NOVARTIS公司)，HBV表面抗体(抗-HBs)、HBV e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、HBV e抗体(抗-HBe)、HBV核心抗体(hepatitis B core antibody，抗-HBc)测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)购自Abbott公司。
1.2.2 仪器所用仪器为Cobas s201全自动核酸分析系统(Roche公司)、Tigris全自动核酸分析系统(GRIFOLS公司)和雅培Ⅰ2000全自动免疫分析仪(Abbott公司)。
1.3 方法 1.3.1 HBV DNA检测395例核酸阳性样本使用Roche或GRIFOLS鉴定检测试剂，分别采用FQ-PCR或TMA进行HBV DNA鉴定试验。
1.3.2 血清学检测所有样本使用化学发光法检测抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc。
1.4 统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。计量资料，非正态资料以中位数四分位数间距表示，组间比较采用Mann-Whitney检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HBsAg阴性献血人群中的HBV DNA鉴定结果样本的血清学特征在395例HBsAg阴性/核酸阳性的样本中有197例HBV DNA鉴定为阳性，确认为OBI，其中抗-HBc阳性者169例(85.79%)，抗-HBs阳性者58例(29.44%)，乙型肝炎血清学标志物全阴性者14例(7.11%)。523例HBsAg阴性/核酸阴性样本，考虑为合格献血者，其中抗-HBc阳性者116例(22.39%)；抗-HBs阳性者288例(54.63%)；乙型肝炎血清学标志物全阴性者221例(42.66%)，两组结果比较差异具统计学意义(P < 0.05)，见表 1。
| HBV serum markers | OBI* (n, %) (n=197) | Qualified blood donors** (n, %) (n=523) | χ2 | P value |
| Anti-HBc(+) n(%) | 169(85.79) | 116(22.39) | 242.1 | < 0.001 |
| Anti-HBs(+) n(%) | 58(29.44) | 288(54.63) | 37.64 | < 0.001 |
| HBV markers(-) n(%) | 14(7.11) | 221(42.66) | 80.41 | < 0.001 |
| HBV: hepatitis B virus；OBI: occult hepatitis B infection; Qualified blood donors: blood donors with normal ALT, negative HBsAg, negative anti-HCV and HIV antigen-antibody, and negative nucleic acid test. *：test group；**：control group. | ||||
OBI组的血清学模式以抗-HBe及抗-HBc阳性为主，占36.55%(72/197例)；合格献血者组以乙型肝炎血清学标志物全阴性为主，占42.26%(221/523例)，其次为抗-HBs单独阳性，占34.94%(186/523例)。两组的血清学模式在抗-HBc、抗-HBs双阳性组及抗-HBc、抗-HBe、抗-HBs三抗体阳性组无统计学差异(P>0.05), 其余各组均有显著差异(P < 0.05)，结果见表 2。
| Mode | HBV serum markers | OBI* (n, %) n=197 |
Qualified blood donors** (n, %) n=523 |
χ2 | P value | ||||
| HBsAg | Anti-HBs | HBeAg | Anti-HBe | Anti-HBc | |||||
| 1 | - | + | - | - | - | 14(7.11) | 186(34.94) | 57.76 | < 0.001 |
| 2 | - | + | - | - | + | 26(13.20) | 58(11.09) | 0.62 | 0.432 |
| 3 | - | + | - | + | + | 18(4.06) | 44(8.41) | 0.10 | 0.757 |
| 4 | - | - | - | + | + | 72(36.55) | 6(1.15) | - | < 0.001 |
| 5 | - | - | - | - | + | 53(26.9) | 8(1.53) | - | < 0.001 |
| 6 | - | - | - | - | - | 14(7.11) | 221(42.26) | 80.41 | < 0.001 |
| HBV: hepatitis B virus；OBI: occult hepatitis B infection; Qualified blood donors: blood donors with normal ALT, negative HBsAg, negative anti-HCV and HIV antigen-antibody, and negative nucleic acid test. *：test group；**：control group. | |||||||||
不同血清学模式下，OBI组与合格献血者组的抗-HBs水平存在差异，除模式6(乙型肝炎血清学标志阴性)两组间无统计学差异外，其余各模式下OBI组的抗-HBs水平均显著低于正常组，差异有统计学意义(P < 0.05)。OBI组的总体抗-HBs水平较合格献血者组低，两组差异有显著的统计学意义(P < 0.001)。结果见表 3。
| Mode | HBV serum markers | OBI* anti-HBs level, log10(mIU/mL) Median (25%, 75%) |
Qualified blood donors** anti-HBs level, log10(mIU/mL) Median(25%, 75%) |
Z value | P value | ||||
| HBsAg | Anti- HBs |
HBeAg | Anti- HBe |
Anti- HBc |
|||||
| 1 | - | + | - | - | - | 1.62(1.29, 2.03) | 2.03(1.53, 2.59) | -2.137 | 0.032 |
| 2 | - | + | - | - | + | 1.57(1.23, 1.84) | 2.28(1.84, 2.57) | -4.492 | < 0.001 |
| 3 | - | + | - | + | + | 1.26(1.13, 1.60) | 2.40(1.79, 3.00) | -4.168 | < 0.001 |
| 4 | - | - | - | + | + | 0.07(-0.37, 0.42) | 0.64(0.34, 0.88) | -2.504 | 0.009 |
| 5 | - | - | - | - | + | 0.16(-0.21, 0.59) | 0.66(0.17, 0.93) | -2.298 | 0.019 |
| 6 | - | - | - | - | - | -1.25(-2.10, 0.37) | -0.23(-0.82, 0.31) | -0.679 | 0.203 |
| Total | 0.39(-0.13, 1.15) | 1.23(-0.05, 2.24) | -0.198 | < 0.001 | |||||
| HBV: hepatitis B virus；OBI: occult hepatitis B infection; Qualified blood donors: blood donors with normal ALT, negative HBsAg, negative anti-HCV and HIV antigen-antibody, and negative nucleic acid test. *：test group；**：control group. | |||||||||
在OBI组中, 有162/169例(95.86%)抗-HBs水平在0~100 mIU/mL之间，101~300 mIU/mL的有3/169例(1.78%)，301~700 mIU/mL有4/169例(2.36%)，>1 000 mIU/mL的样本数为0。在合格献血者组，抗-HBs水平在0~100mIU/mL有46/116例(39.66%)，远低于OBI组，101~300 mIU/mL有29/116例(25%)，抗-HBs >1 000 mIU/mL，有20/116例(17.24%)。两组的抗-HBs水平比较，差异有统计学意义(χ2=112，P < 0.05)。结果见表 4。
| Anti-HBs (mIU/mL) |
OBI* (n, %) |
Qualified blood donors** (n, %) |
| 0-100 | 162(95.86) | 46(39.66) |
| 101-300 | 3(1.78) | 29(25) |
| 301-700 | 4(2.36) | 16(13.79) |
| 701-1 000 | 0(0) | 5(4.31) |
| >1 000 | 0(0) | 20(17.24) |
| Total | 169(100) | 116(100) |
| OBI: occult hepatitis B infection; Qualified blood donors: blood donors with normal ALT, negative HBsAg, negative anti-HCV and HIV antigen-antibody, and negative nucleic acid test. *：test group; **：control group. | ||
根据欧洲及中国的指南，目前OBI的诊断标准是HBsAg阴性而肝内或血液中检测到HBV DNA。血液中抗-HBc检测常当替代方法[3, 7]。HBsAg主要来自感染的干细胞核内的cccDNA，还可以来源于整合的HBV DNA片段转录翻译。目前由于检测灵敏度不高或在HBV基因组S区变异可能出现假阴性结果，因此，OBI可能被漏诊[8-9]。各地区的人群分布及检测方法灵敏度不一致，导致目前报道的OBI在国内不同地区人群中的流行率相差较大。既往回顾性研究发现上海地区的HBsAg阴性献血人群中HBV DNA阳性率为0.036%[10]，而国内其他地区的感染率在0.06%-0.34%不等[11-14]。我国目前应用于输血前筛查的核酸检测方法具有较高的特异性(99.9%)，上海地区用于筛查的核酸检测试剂最低检测限95%可信度可达3.4 IU/ml，能够筛选出低水平的HBV DNA。但是国外仍有研究发现，经此核酸检测方法筛检阴性献血者仍有可能将HBV传播给受血者[15]。因此，除了核酸检测，对HBV感染后血清中出现的其他标志物的研究可能也有助于OBI的诊断。通常抗-HBc及抗-HBs是HBV感染后获得免疫的标志。有研究发现抗-HBc在乙型肝炎感染的不同阶段均有不同的表达水平[16]。而在一项对使用免疫治疗的淋巴瘤患者的研究中发现，抗-HBc及抗-HBs水平与HBV再激活有关[17]。
本研究通过对核酸检测筛选出的395例阳性样本进行HBV DNA检测，发现其中197例阳性，为OBI。在OBI者中，抗-HBc阳性者占85.79%，略低于安等报道的90.2%，而抗-HBs阳性率29.44%，远低于安等报道的62.75%[18]，可能与本研究的样本量较后者更大有关。而在OBI与合格献血者的血清学模式比较中发现，OBI组以抗-HBe和抗-HBc阳性(36.55%)及抗-HBc单独阳性(26.9%)居多，合格献血者组则以血清学阴性(42.26%)及抗-HBs单独阳性(34.94%)为主。结果表明抗-HBc的存在与OBI密切相关，与文献报道一致[19]。此外，既往研究显示，抗-HBc和抗-HBs共存时，当抗-HBs滴度为(20~60) mIU/mL时，输血感染率可以减少4/5[20]，也有报道认为抗-HBs>100 mIU/L的血液是安全的[21-22]。而本研究发现，在抗-HBc阳性的合格献血者中，抗-HBs>100 mIU/ml有70例(70/169)，占60.34%，但在抗-HBc阳性的OBI感染者中，亦有7例(7/169)的抗-HBs>100 mIU/mL，表明在某些条件下这些感染者体内仍存在的病毒可能出现再激活，提示即使有较高水平的抗-HBs仍不能完全排除OBI感染。另外，本研究发现OBI组抗-HBs均 < 1 000 mIU/mL，在正常献血者组>1 000 mIU/mL的样本数有20例，由此可推断，抗-HBs>1 000 mIU/mL才可以提示HBV被彻底清除。
研究也发现，有198例核酸检测阳性而进一步HBV DNA鉴定呈阴性的不确定样本，造成这一结果的原因可能与核酸检测方法的灵敏度(HBV DNA 3.4 MIU/mL)稍高于鉴别试验灵敏度(4.1 mIU/mL)有关[23]。有研究认为HBV DNA鉴定检测阴性并不表示无病毒感染，而是病毒载量较低，目前核酸检测方法只能概率性检出[24]。这些样本需要更敏感的方法进行检测以确认是否为OBI[25]，限于条件所限，本研究未对这部分样本进行进一步更高灵敏度的HBV DNA检测或追踪样本的感染情况，这些工作会在后续的研究中进行。
综上所述，本研究结果初步说明，上海地区献血人群中大部分的OBI者血清中可检测到HBV感染后的血清学标志物，但与合格献血者组血清学标志物分布有差异。OBI者中大部分存在抗-HBc，而抗-HBc阳性的OBI者其抗-HBs水平低于抗-HBc阳性的合格献血者。本研究结果提示，抗-HBc阳性且抗-HBs较高水平的人体内仍可能检测出HBV DNA，而抗-HBs>1 000 mIU/mL预示着HBV感染后的彻底清除。
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