文章快速检索     高级检索
  微生物与感染  2020, Vol. 15 Issue (6): 385-392      DOI: 10.3969/j.issn.1673-6184.2020.06.007
0
Contents            PDF            Abstract             Full text             Fig/Tab
基线血清外泌体miR-155-5p联合乙型肝炎病毒DNA定量实验预测聚乙二醇干扰素治疗乙型肝炎e抗原阳性慢性乙型肝炎的疗效
胡乾坤 , 王倩倩 , 李强 , 黄晨璐 , 许伟 , 张毅 , 李新艳 , 陈良 , 黄玉仙     
复旦大学附属公共卫生临床中心肝病科,上海 201508
摘要:探讨聚乙二醇干扰素(peginterferon, Peg-IFN)治疗乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者48周后,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平联合乙型肝炎病毒DNA定量实验在预测HBeAg血清学转换中的价值。回顾性分析2016年6月至2019年6月在本中心初次接受抗病毒治疗的HBeAg阳性CHB患者88例。根据Peg-IFN治疗48周后是否发生HBeAg血清学转换,将患者分为治疗应答组和无应答组。采用多因素logistic回归探讨预测Peg-IFN治疗应答的因子,并应用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线下面积评估预测效能。结果发现基线血清外泌体miR-155-5p(OR=2.193,95% CI 1.315~3.655,P=0.003)和HBV DNA(OR=0.398,95% CI 0.163~0.976,P=0.036)是Peg-IFN治疗效果的独立预测因子。基线血清外泌体miR-155-5p和HBV DNA的截断值分别取2.3和7.2 log10IU/mL时,相应的ROC曲线下面积分别为0.788(95% CI 0.682~0.893)和0.704(95% CI 0.577~0.824)。基线血清外泌体miR-155-5p表达水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的患者,Peg-IFN治疗48周后其HBeAg血清学转换率最高,为66.67% (10/15);而基线血清外泌体miR-155-5p表达水平 < 2.3且HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的患者,Peg-IFN治疗48周后其HBeAg血清学转换率最低,仅为3.03%(1/33)。这些结果表明,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平联合HBV DNA定量实验可以作为Peg-IFN治疗HBeAg阳性CHB疗效的预测因子,对于优化CHB的抗病毒治疗有积极作用。
关键词乙型肝炎,慢性    外泌体    miR-155-5p    乙型肝炎病毒DNA    聚乙二醇干扰素    
Baseline serum exosomal miR-155-5p combined with HBV DNA can predict HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B patients receiving peginterferon
HU Qiankun , WANG Qianqian , LI Qiang , HUANG Chenlu , XU Wei , ZHANG Yi , LI Xinyan , CHEN Liang , HUANG Yuxian     
Department of Hepatology, Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
Abstract: The aim of the present study was to explore the value of baseline serum exosomal miR-155-5p expression level combined with HBV DNA quantification in predicting HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B (CHB) patients treated with peginterferon (Peg-IFN) for 48 weeks. A total of 88 HBeAg-positive CHB patients who initially received Peg-IFN therapy in our hospital from June 2016 to June 2019 were retrospectively analyzed. Patients were divided into treatment response and non-response group according to HBeAg seroconversion after Peg-IFN treatment for 48 weeks. Multivariate logistic regression analysis was performed to identify predictors of treatment response, and the area under receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the predictive efficacy. The results indicated that baseline serum exosomal miR-155-5p [odds ratio (OR) =2.193, 95% confidence interval (CI) 1.315~3.655, P=0.003] and HBV DNA (OR=0.398, 95% CI 0.163~0.976, P=0.036) were independent predictors for HBeAg seroconversion. The optimal cut-off value of baseline serum exosomal miR-155-5p and HBV DNA were 2.3 and 7.2 log10IU/mL, respectively; and the corresponding area under ROC curves were 0.788 (95% CI 0.682~0.893) and 0.704 (95% CI 0.577~0.824), respectively. Patients with baseline serum exosomal miR-155-5p expression level ≥2.3 and HBV DNA ≤7.2 log10IU/mL had 66.67% (10/15) rates of HBeAg seroconversion, whereas the rates of HBeAg seroconversion among patients with unfavorable baseline characteristics were only 3.03% (1/33). Taken together, these results suggest that baseline serum exosomal miR-155-5p combined with HBV DNA quantification may serve as a useful predictor of Peg-IFN therapy efficacy in HBeAg-positive CHB patients.
Keywords: Hepatitis B, Chronic    Exosome    miR-155-5p    Hepatitis B virus DNA    Peginterferon    

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行,严重影响人类健康。全球约有2.48亿慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染相关疾病[1],尽早规范抗病毒治疗对于延缓疾病进展、改善患者生命质量至关重要。目前,聚乙二醇干扰素(peginterferon, Peg-IFN)是治疗乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的一线药物之一。虽然它能够在有限的疗程里提高HBeAg血清学转换率[2],但仍有近2/3患者的治疗结果不理想。研究表明基线高水平丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、低水平HBV DNA、HBV基因型[3]以及治疗过程中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和HBV DNA的动态变化[4]等可作为Peg-IFN治疗后是否发生HBeAg血清学转换的预测因子。然而,上述临床参数多为病毒相关预测因子,有关宿主免疫功能的预测因子较少涉及。

microRNAs(miRNAs, miR)是一类在转录后水平调控靶基因表达的非编码小RNA[5]。HBV感染会改变宿主miRNAs谱,进而影响病毒-宿主相互作用。其中,miR-155表达上调与CHB患者外周血免疫细胞活化密切相关[6, 7],它能通过靶向细胞因子信号抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)促进JAK/STAT信号通路活化从而增强固有免疫的抗HBV效应[8],而且外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中基线miR-155表达水平能预测抗病毒治疗应答[6]。循环中的miRNAs能够以游离、核酸-蛋白复合物或包裹在外泌体的膜性囊泡等多种形式存在。随着检测技术的发展,外泌体源性miRNAs在诊断和预测疾病预后方面的价值逐渐得到显现[9, 10]。循环中的miR-155-5p能否作为预测Peg-IFN治疗HBeAg阳性CHB疗效的指标尚不明确。为此,本研究回顾性分析了88例初次接受Peg-IFN治疗的HBeAg阳性CHB患者的临床资料,分别检测基线血清和血清外泌体miR-155-5p表达水平,探讨循环中的miR-155-5p及其他指标对于Peg-IFN疗效的预测效能,期望为临床治疗提供参考。

1 材料和方法 1.1 研究对象

纳入2016年6月至2019年6月在本中心肝病科初次接受Peg-IFN治疗且完成48周疗程的HBeAg阳性CHB患者88例。所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]的诊断标准及Peg-IFN抗病毒治疗标准。排除标准包括:①HBeAg和抗-HBe同时阳性;②入选前曾接受过抗病毒治疗;③合并其他病毒感染,如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus, HDV)和戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)等;④服用免疫抑制剂(包括糖皮质激素类药物)或免疫功能缺陷;⑤基线血清不足或不可获得;⑥未完成48周Peg-IFN治疗。同时,选取24例健康受试者作为对照。本研究通过了本中心伦理委员会批准,所有入组患者和健康受试者均签署了知情同意书,研究程序符合1975年《赫尔辛基宣言》。

1.2 治疗方案和判断标准

Peg-IFNα-2a (派罗欣,180 μg/0.5 mL,上海罗氏制药有限公司) 180 μg皮下注射,每周1次,连续治疗48周。根据患者是否发生HBeAg血清学转换分为治疗应答组和治疗无应答组。

1.3 基线血清miRNA、血清外泌体总RNA提取及miR-155-5p表达水平检测

使用miRcute Serum/Plasma miRNA Isolation Kit(Cat No./ID:DP503, 北京天根生化科技有限公司)提取血清总miRNA。使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (Cat No./ID: 77044, 德国Qiagen公司)提取血清外泌体[12],经透射电子显微镜和蛋白质印迹法鉴定[13]后用QIAzol裂解外泌体并提取总RNA。使用miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit (Cat No./ID: C10712-1,广州锐博生物科技有限公司)通过加polyA尾反转录法分别获取总cDNA,再通过miR-155-5p特异的正向引物序列(5′-AAGCGACCTTAATGCTAATCGTGAT-3′)和通用反向引物序列(5′-CAGTGCAGGGTCCG-AGGT-3′)进行聚合酶链反应(poly merase chain reaction, PCR)扩增。扩增程序为:95 ℃ 10 min预变性后,95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s,重复40个循环。PCR仪器为StepOne PlusTM实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。每个样本均重复测定3次。以Cel-miR-39为标准化外参,使用2-ΔΔCT方法[14]计算miR-155-5p的相对表达水平。

1.4 常规实验室指标检测

血常规检测采用全自动血细胞分析仪BC-3000 Plus(深圳迈瑞生物医疗有限公司)。肝功能检测采用全自动生化分析仪7600 Series(日本日立公司)。HBV免疫标志物采用全自动化学发光免疫分析仪ARCHITECTi 2000SR及配套专用试剂(美国雅培公司)。HBV DNA检测采用HBV核酸定量检测试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司),使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)进行扩增检测,最低检测下限为100 IU/mL。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0进行统计分析。正态分布的连续性变量以均值±标准差( x±s)表示,方差齐性的两组数据采用t检验,方差不齐的两组数据采用t′检验。非正态分布的连续性变量以中位数(四分位数间距)[M(P25~P75)]表示,两组间采用Mann-Whitney U检验。分类变量以n(%)表示,两组间采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。应用ROC曲线下面积评估基线指标对HBeAg血清学转换的预测效能。

2 结果 2.1 入组患者基线特征

入组患者基线资料见表 1。88例CHB患者中,男性57例,女性31例,Peg-IFN治疗48周发生HBeAg血清学转换20例(22.73%)。以健康受试者为对照,CHB患者基线血清miR-155-5p(图 1AP=0.046)和血清外泌体miR-155-5p(图 1BP=0.011)均有不同程度升高。根据Peg-IFN治疗结局将CHB患者分为治疗应答组与无应答组,两组间的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰胺转肽酶、总胆红素、白蛋白、球蛋白、HBV基因型、HBsAg定量(表 1)和血清miR-155-5p表达水平(图 1A)无统计学差异(P值均>0.05)。治疗应答组与治疗无应答组相比,前者基线ALT(P=0.027)和血清外泌体miR-155-5p表达水平(图 1BP < 0.001) 明显更高,而基线HBeAg(P=0.011)和HBV DNA定量(P=0.007)明显更低。

表 1 入组患者基线特征(n=88) Tab. 1 Baseline characteristics of enrolled patients (n=88)
Parameters Non-response (n=68) Response (n=20) P Value
Age (years) 30.0 (27.0-36.0) 30.0 (27.0-35.5) 0.838
Male, n (%) 46 (67.65) 11 (55.00) 0.300
WBC (109/L) 5.35 (4.73-5.82) 5.34 (4.79-6.15) 0.426
HB (g/L) 148.0 (136.3-158.8) 139.5 (126.0-157.8) 0.215
PLT (109/L) 182.6±46.7 186.5±30.0 0.666
ALT (ULN) 2.90 (1.76-4.65) 5.28 (2.28-7.61) 0.027
AST (ULN) 1.55 (1.01-2.39) 2.19 (1.29-2.80) 0.085
AKP (IU/L) 75.0 (64.3-86.8) 84.0 (64.0-101.3) 0.208
γ-GT (IU/L) 40.0 (22.3-81.0) 62.0 (39.3-88.3) 0.078
TBIL (μmol/L) 13.7 (11.1-16.4) 13.0 (8.6-17.9) 0.636
ALB (g/L) 41.34±4.21 42.07±3.50 0.481
GLB (g/L) 29.95±4.64 31.43±4.38 0.210
HBV genotype, n (%)
B 33 (48.53) 12 (60.00) 0.367
C 35 (51.47) 8 (40.00)
HBsAg (log10 IU/mL) 4.07±0.58 3.89±0.60 0.197
HBeAg (log10 S/CO) 2.96 (2.20-3.16) 2.62 (1.93-2.87) 0.011
HBV DNA (log10 IU/mL) 7.46 (6.63-7.74) 6.67 (6.27-7.14) 0.007
Serum miR-155-5p (relative fold change) 1.067 (0.630-1.963) 1.371 (1.004-1.860) 0.084
Serum exosomal miR-155-5p (relative fold change) 1.308 (0.677-2.172) 2.424 (1.769-3.400) < 0.001
WBC, white blood cell; HB, Hemoglobin; PLT, platelet count; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; γ-GT, γ-glutamyl transpeptidase; TBIL, total bilirubin; ALB, albumin; GLB, globulin; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HBeAg, hepatitis B e antigen; ULN, upper limit of normal (ULN=40 IU/L).
A: Comparison of baseline serum miR-155-5p expression levels between healthy controls and total CHB patients, treatment non-response and response group. B: Comparison of baseline serum exosomal miR-155-5p expression levels between healthy controls and total CHB patients, treatment non-response and response group. Healthy controls were normalized to 1. HC, healthy controls; CHB, chronic hepatitis B; Non-R, non-response; R, response. 图 1 基线血清和血清外泌体miR-155-5p在CHB患者和健康对照组中的相对表达量 Fig. 1 Baseline serum and serum exosomal miR-155-5p expression levels in enrolled CHB patients and HC
2.2 基线指标与Peg-IFN疗效的关系

采用单因素logistic回归分析年龄、性别、ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA、血清miR-155-5p及血清外泌体miR-155-5p与Peg-IFN疗效的相关性,筛查有统计学意义的预测因子,然后共同纳入多因素logistic回归模型。结果发现,基线血清外泌体miR-155-5p(OR=2.193,95% CI 1.315~3.655,P=0.003)和HBV DNA(OR=0.398,95% CI 0.163~0.976,P=0.036)是Peg-IFN治疗48周后发生HBeAg血清学转换的独立预测因子(表 2)。

表 2 Logistic回归分析与干扰素治疗应答的相关指标 Tab. 2 Logistic regression analysis of baseline parameters to predict HBeAg seroconversion at week 48
Parameters Univariate analysis Multivariate analysis
OR (95% CI) P Value OR (95% CI) P Value
Age (years) 1.002 (0.923-1.088) 0.960
Gender (male vs female) 0.585 (0.211-1.616) 0.301
ALT (ULN) 1.297 (1.051-1.601) 0.016 1.215 (0.959-1.540) 0.107
AST (ULN) 1.209 (0.310-1.838) 0.310
HBsAg (log10 IU/mL) 0.570 (0.242-1.342) 0.198
HBeAg (log10 S/CO) 0.442 (0.205-0.954) 0.038 0.773 (0.255-2.342) 0.348
HBV DNA (log10 IU/mL) 0.421 (0.227-0.779) 0.006 0.398 (0.163-0.976) 0.036
Serum miR-155-5p (relative fold change) 1.609 (0.808-3.203) 0.176
Serum exosomal miR-155-5p (relative fold change) 2.279 (1.411-3.683) 0.001 2.193 (1.315-3.655) 0.003
ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HBeAg, hepatitis B e antigen; ULN, upper limit of normal; CI, confidence interval.
2.3 基线血清外泌体miR-155-5p和HBV DNA对Peg-IFN疗效的预测效能

采用ROC曲线下面积评估基线血清外泌体miR-155-5p表达水平和HBV DNA定量水平对HBeAg血清学转换的预测效能,并根据约登指数选择最佳截断值。结果发现,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平在2.3时,ROC曲线下面积为0.788(95% CI 0.682~0.893),相应的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为65.0%、82.4%、52.0%和88.9%(表 3)。当基线HBV DNA定量水平在7.2 log10IU/mL时,ROC曲线下面积为0.704(95% CI 0.577~0.824),相应的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为80.0%、57.4%、35.6%和90.7%(表 3)。两者联合后的ROC曲线下面积将增加到0.823(95% CI 0.721~0.924)(图 2)。

表 3 基线血清外泌体miR-155-5p和HBV DNA对治疗应答的预测效能 Tab. 3 Predictive value of baseline serum exosomal miR-155-5p and HBV DNA for HBeAg seroconversion at week 48
Parameters Cut-off values Youden index Se (%) Sp (%) PPV (%) NPV (%)
Serum exosomal miR-155-5p (relative fold change) 1.01 0.28 90.0 38.2 30.5 93.1
1.62 0.45 85.0 60.3 38.6 93.2
2.30 0.47 65.0 82.4 52.0 88.9
3.03 0.24 30.0 94.1 60.0 82.1
3.81 0.11 15.0 95.6 50.0 79.3
HBV DNA (log10 IU/mL) 5.99 0.13 20.0 92.7 44.4 79.5
6.57 0.24 45.0 79.4 39.1 83.3
7.20 0.37 80.0 57.4 35.6 90.7
7.53 0.31 85.0 45.6 31.5 91.2
7.89 0.16 95.0 20.6 25.0 87.5
The optimal cut-off value was defined by maximizing Youden index (sensitivity+specificity-1). Se, sensitivity; Sp, specificity; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value.
图 2 基线血清外泌体miR-155-5p、HBV DNA以及联合应用对Peg-IFN疗效的预测效能 Fig. 2 The area under ROC curves of baseline serum exosomal miR-155-5p, HBV DNA and their combination for predicting HBeAg seroconversion
2.4 不同基线特征CHB患者的HBeAg血清学转换率比较

根据基线血清外泌体miR-155-5p表达水平(截断值2.3)和HBV DNA定量水平(截断值7.2 log10IU/mL)的不同,将入组CHB患者分为不同亚组,比较各亚组经Peg-IFN治疗48周后的HBeAg血清学转换率。结果发现,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的15例患者中,有10例发生了HBeAg血清学转换(66.67%);基线血清外泌体miR-155-5p表达水平≥2.3但HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的10例患者中,有3例发生了HBeAg血清学转换(30.00%);基线血清外泌体miR-155-5p表达水平 < 2.3但HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的30例患者中,有6例发生了HBeAg血清学转换(20.00%);而基线血清外泌体miR-155-5p表达水平 < 2.3且HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的33例患者中,仅1例发生了HBeAg血清学转换(3.03%)(图 3)。

"Y" denotes yes, and "N" denotes no. 图 3 不同基线特征CHB患者的HBeAg血清学转换率比较 Fig. 3 Treatment response among subgroups of patients stratified by parameters at baseline
3 讨论

对于HBeAg阳性CHB患者而言,经Peg-IFN治疗后实现HBeAg血清学转换标志着部分免疫控制和长期病毒学抑制,是抗病毒治疗应答的关键指标。在临床实践中,根据早期参数预测Peg-IFN的疗效,有助于对CHB患者的抗病毒方案进行优化。本研究发现,基线血清外泌体miR-155-5p表达水平和HBV DNA定量水平均可作为Peg-IFN治疗48周发生HBeAg血清学转换的独立预测因子。基线血清外泌体miR-155-5p预测Peg-IFN疗效的最佳截断值是2.3,相应的ROC曲线下面积为0.788,灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为65.0%、82.4%、52.0%和88.9%。基线HBV DNA预测Peg-IFN疗效的最佳截断值是7.2 log10IU/mL,相应的ROC曲线下面积为0.704,灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为80.0%、57.4%、35.6%和90.7%。

miR-155位于人类21号染色体B细胞整合簇(B-cell Integration Cluster,BIC)基因的第3个外显子内,它在血细胞发育、肿瘤生成、免疫应答和炎症反应等方面发挥调控作用[15]。Wang等[16]研究发现口腔疱疹病毒感染能诱导巨噬细胞产生miR-155,并能直接靶向SOCS1激活IFN信号通路来增强固有免疫系统抗病毒能力。此外,对于免疫耐受或免疫缺陷患者来说,因免疫细胞功能障碍造成的SOCS1表达增加和miR-155表达下调,可能是他们对IFN抗病毒或抗肿瘤治疗反应不佳的原因。Sarkar等[17]发现HBV感染者miR-155表达和Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)表达呈正相关,体外实验表明miR-155通过靶向CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP-β)抑制HBV复制。Ge等[6]发现miR-155表达下调与CHB患者外周血自然杀伤(natural killer,NK)细胞的功能障碍密切相关,在活化的NK细胞中过表达miR-155能明显促进IFN-γ和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)的生成。Fang等[7]则发现miR-155表达水平与CHB患者CD4+和CD8+ T细胞的活化呈正相关,提示前者可能是慢性HBV感染者免疫激活的潜在标志物。本研究同样发现,免疫活动期的CHB患者机体免疫耐受被打破,肝脏炎症反应明显,血清miR-155-5p和血清外泌体miR-155-5p表达水平均有不同程度升高。因此,miR-155-5p在病毒与宿主相互作用,尤其是在慢性HBV感染与机体免疫应答过程中发挥重要调控作用。

既往研究表明CHB患者PBMCs、循环以及肝组织中存在特异变化的miRNAs,并且基线PBMCs和循环中差异表达的miRNAs可以作为Peg-IFN疗效的预测因子[18, 19]。然而,基线循环中的miR-155-5p是否存在差异表达以及能否作为Peg-IFN治疗HBeAg阳性CHB患者的疗效预测因子尚不明确。为此,本研究以健康受试者为对照,检测了治疗应答和无应答组基线血清miR-155-5p表达水平,结果并未发现两组间的表达有统计学差异(P=0.084)。进一步检测基线血清外泌体miR-155-5p的表达水平,结果发现两组间表达存在显著差异(P < 0.001),并且能够用于预测Peg-IFN的疗效。虽然HBeAg阳性CHB患者的血清和血清外泌体miR-155-5p表达水平均有不同程度升高,但基线血清外泌体miR-155-5p对于预测Peg-IFN的疗效更具优势。分析原因如下:①外泌体的囊泡结构能保护miRNA分子免受循环中RNA酶的降解[20],从而增强了其作为标志物的稳定性和诊断潜能。②外泌体的内容物与血清或血浆样本并不完全一致,有些差异表达miRNAs可能在外泌体中富集[21]。在CpG联合脂多糖诱导的肝损伤模型中,血浆外泌体源性miR-155表达明显增加,而血浆蛋白结合的miR-155表达明显减少[22]。Matsuura等[23]也发现慢性丙型肝炎患者的肝组织、血浆和血浆外泌体中的let-7s表达水平无相关性。③基于外泌体的生物标志物分析与血清或血浆样本相比,前者样本内容物的复杂性明显降低,一定程度上减少了血清或血浆复杂背景所造成的干扰[24]。④miRNAs并非随机包裹进入外泌体,机体在不同病理生理状态下具有引导特异miRNAs进入外泌体的分选机制[25]。因此,我们推测HBeAg阳性CHB患者血清外泌体miR-155-5p的高表达,一定程度上反映了宿主免疫耐受的打破和免疫功能的重建,活化的免疫细胞合成的miR-155-5p会优先分选进入外泌体,而治疗应答组CHB患者处于相对较高的免疫激活状态,体内免疫细胞合成并释放外泌体miR-155-5p的能力更强,在此基础上应用IFN治疗相对容易实现HBeAg血清学转换。

基线HBV DNA定量在预测Peg-IFN疗效中的价值已得到多个研究证实。对于HBV基因型B型或C型的CHB患者来说,基线低水平HBV DNA(< 2×108 IU/mL)和基线高水平ALT(≥2ULN)的患者更可能对Peg-IFN治疗产生应答[3]。Fan等[26]研究表明基线低水平HBV DNA(<9 log10copies/mL)和基线高水平乙型肝炎核心抗体(hepatitis B core antibody, HBcAb)(≥ 4.4log10IU/mL)的CHB患者,经Peg-IFN治疗后有65.8%(50/76)发生HBeAg血清学转换。本研究同样发现,将基线血清外泌体miR-155-5p和HBV DNA联合分析,能进一步提高对Peg-IFN疗效的预测效能。基线血清外泌体miR-155-5p表达水平≥2.3且HBV DNA定量≤7.2 log10IU/mL的患者,Peg-IFN治疗48周后的HBeAg血清学转换率最高,达到66.67%(10/15),而基线血清外泌体miR-155-5p表达水平 < 2.3且HBV DNA定量>7.2 log10IU/mL的患者,Peg-IFN治疗48周后的HBeAg血清学转换率最低,仅为3.03%(1/33)。

本研究也存在一定局限性。首先,本研究属于单中心的回顾性队列研究,纳入的患者数量有限,部分患者因信息缺失或治疗中断而排除,这可能会对研究结果造成偏倚,因此需要大样本的前瞻性队列研究来验证现有结论的真实性和可靠性。其次,基线血清外泌体miR-155-5p预测Peg-IFN疗效的具体作用机制以及Peg-IFN治疗过程中血清外泌体miR-155-5p的动态变化情况有待进一步研究。

综上所述,基线血清外泌体miR-155-5p联合HBV DNA定量可以预测Peg-IFN治疗HBeAg阳性CHB患者48周发生的血清学转换。研究对于优化HBeAg阳性CHB患者的抗病毒治疗方案及提高Peg-IFN抗病毒治疗效果可能有积极作用。

参考文献
[1]
Schweitzer A, Horn J, Mikolajczyk RT, Krause G, Ott JJ. Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a systematic review of data published between 1965 and 2013[J]. Lancet, 2015, 386(10003): 1546-1555. [DOI]
[2]
Lau GK, Piratvisuth T, Luo KX, Marcellin P, Thongsawat S, Cooksley G, Gane E, Fried MW, Chow WC, Paik SW, Chang WY, Berg T, Flisiak R, Mccloud P, Pluck N, Peginterferon Alfa-2a HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B Study Group. Peginterferon Alfa-2a, lamivudine, and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J]. N Engl J Med, 2005, 352(26): 2682-2695. [DOI]
[3]
Buster EH, Hansen BE, Lau GK, Piratvisuth T, Zeuzem S, Steyerberg EW, Janssen HL. Factors that predict response of patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B to peginterferon-alfa[J]. Gastroenterology, 2009, 137(6): 2002-2009. [DOI]
[4]
Piratvisuth T, Marcellin P, Popescu M, Kapprell HP, Rothe V, Lu ZM. Hepatitis B surface antigen: association with sustained response to peginterferon alfa-2a in hepatitis B e antigen-positive patients[J]. Hepatol Int, 2013, 7(2): 429-436. [DOI]
[5]
Beermann J, Piccoli MT, Viereck J, Thum T. Non-coding RNAs in development and disease: Background, mechanisms, and therapeutic approaches[J]. Physiol Rev, 2016, 96(4): 1297-1325. [DOI]
[6]
Ge J, Huang Z, Liu H, Chen J, Xie Z, Chen Z, Peng J, Sun J, Hou J, Zhang X. Lower expression of microRNA-155 contributes to dysfunction of natural killer cells in patients with chronic hepatitis B[J]. Front Immunol, 2017, 8: 1173. [DOI]
[7]
Fang J, Zhuge L, Rao H, Huang S, Jin L, Li J. Increased levels of miR-155 are related to higher T-cell activation in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2019, 23(2): 118-123. [DOI]
[8]
Su C, Hou Z, Zhang C, Tian Z, Zhang J. Ectopic expression of microRNA-155 enhances innate antiviral immunity against HBV infection in human hepatoma cells[J]. Virol J, 2011, 8: 354. [DOI]
[9]
Lugli G, Cohen AM, Bennett DA, Shah RC, Fields CJ, Hernandez AG, Smalheiser NR. Plasma exosomal miRNAs in persons with and without Alzheimer disease: Altered expression and prospects for biomarkers[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e139233. [DOI]
[10]
Min L, Zhu S, Chen L, Liu X, Wei R, Zhao L, Yang Y, Zhang Z, Kong G, Li P, Zhang S. Evaluation of circulating small extracellular vesicles derived miRNAs as biomarkers of early colon cancer: a comparison with plasma total miRNAs[J]. J Extracell Vesicles, 2019, 8(1): 1643670. [DOI]
[11]
中华医学会肝病学分会, 中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)[J]. 中华肝脏病杂志, 2015, 23(12): 888-905. [DOI]
[12]
Enderle D, Spiel A, Coticchia CM, Berghoff E, Mueller R, Schlumpberger M, Sprenger-Haussels M, Shaffer JM, Lader E, Skog J, Noerholm M. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method[J]. PLoS One, 2015, 10(8): e136133. [DOI]
[13]
王倩倩, 卢川, 陈良, 黄玉仙. 不同血清量标本外泌体提取及微小RNA的检测结果比较[J]. 微生物与感染, 2018, 13(3): 165-170. [DOI]
[14]
Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108. [DOI]
[15]
Seddiki N, Brezar V, Ruffin N, Lévy Y, Swaminathan S. Role of miR-155 in the regulation of lymphocyte immune function and disease[J]. Immunology, 2014, 142(1): 32-38. [DOI]
[16]
Wang P, Hou J, Lin L, Wang C, Liu X, Li D, Ma F, Wang Z, Cao X. Inducible microRNA-155 feedback promotes type Ⅰ IFN signaling in antiviral innate immunity by targeting suppressor of cytokine signaling 1[J]. J Immunol, 2010, 185(10): 6226-6233. [DOI]
[17]
Sarkar N, Panigrahi R, Pal A, Biswas A, Singh SP, Kar SK, Bandopadhyay M, Das D, Saha D, Kanda T, Sugiyama M, Chakrabarti S, Banerjee A, Chakravarty R. Expression of microRNA-155 correlates positively with the expression of Toll-like receptor 7 and modulates hepatitis B virus via C/EBP-β in hepatocytes[J]. J Viral Hepat, 2015, 22(10): 817-827. [DOI]
[18]
Pan XB, Ma H, Jin Q, Wei L. Characterization of microRNA expression profiles associated with hepatitis B virus replication and clearance in vivo and in vitro[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012, 27(4): 805-812. [DOI]
[19]
Li J, Zhang X, Chen L, Zhang Z, Zhang J, Wang W, Wu M, Shi B, Zhang X, Kozlowski M, Hu Y, Yuan Z. Circulating miR-210 and miR-22 combined with ALT predict the virological response to interferon-alpha therapy of CHB patients[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 15658. [DOI]
[20]
EL Andaloussi S, Mäger I, Breakefield XO, Wood MJ. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities[J]. Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(5): 347-357. [DOI]
[21]
Huang X, Yuan T, Tschannen M, Sun Z, Jacob H, Du M, Liang M, Dittmar RL, Liu Y, Liang M, Kohli M, Thibodeau SN, Boardman L, Wang L. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 319. [DOI]
[22]
Bala S, Petrasek J, Mundkur S, Catalano D, Levin I, Ward J, Alao H, Kodys K, Szabo G. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases[J]. Hepatology, 2012, 56(5): 1946-1957. [DOI]
[23]
Matsuura K, De Giorgi V, Schechterly C, Wang RY, Farci P, Tanaka Y, Alter HJ. Circulating let-7 levels in plasma and extracellular vesicles correlate with hepatic fibrosis progression in chronic hepatitis C[J]. Hepatology, 2016, 64(3): 732-745. [DOI]
[24]
Boukouris S, Mathivanan S. Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers[J]. Proteomics Clin Appl, 2015, 9(3-4): 358-367. [DOI]
[25]
Goldie BJ, Dun MD, Lin M, Smith ND, Verrills NM, Dayas CV, Cairns MJ. Activity-associated miRNA are packaged in Map1b-enriched exosomes released from depolarized neurons[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(14): 9195-9208. [DOI]
[26]
Fan R, Sun J, Yuan Q, Xie Q, Bai X, Ning Q, Cheng J, Yu Y, Niu J, Shi G, Wang H, Tan D, Wan M, Chen S, Xu M, Chen X, Tang H, Sheng J, Lu F, Jia J, Zhuang H, Xia N, Hou J, Chronic Hepatitis B Study Consortium. Baseline quantitative hepatitis B core antibody titre alone strongly predicts HBeAg seroconversion across chronic hepatitis B patients treated with peginterferon or nucleos(t)ide analogues[J]. Gut, 2016, 65(2): 313-320. [DOI]

文章信息

胡乾坤, 王倩倩, 李强, 黄晨璐, 许伟, 张毅, 李新艳, 陈良, 黄玉仙
HU Qiankun, WANG Qianqian, LI Qiang, HUANG Chenlu, XU Wei, ZHANG Yi, LI Xinyan, CHEN Liang, HUANG Yuxian
基线血清外泌体miR-155-5p联合乙型肝炎病毒DNA定量实验预测聚乙二醇干扰素治疗乙型肝炎e抗原阳性慢性乙型肝炎的疗效
Baseline serum exosomal miR-155-5p combined with HBV DNA can predict HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B patients receiving peginterferon
微生物与感染, 2020, 15(6): 385-392.
Journal of Microbes and Infections, 2020, 15(6): 385-392.
通信作者
黄玉仙
E-mail:yxhuang@fudan.edu.cn
基金项目
上海申康医院发展中心市级医院新兴前沿技术联合攻关项目(SHDC12017125),上海市科学技术委员会医学引导类科技项目(18411966500)

工作空间