艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者由于机体免疫功能低下，极易导致各种机会性感染。结核病(tuberculosis，TB)是艾滋病患者最常见的机会性感染性疾病和最重要的致死原因，两病并存时病情复杂，诊治难度大，死亡风险明显增加^[1]，但准确诊断、及时治疗可明显改善患者的生存状况和预后。目前，肺结核的诊断仍然强调病原学依据，包括痰涂片、痰培养及结核病分子生物学检测，我国经病原学确诊肺结核的比率在25.9%以下，与《“十三五”全国结核病防治规划》中规定的50%还有一定的差距^[2]。分枝杆菌培养耗时长，但具有可进行菌种鉴定和药敏试验的优点，成为病原学诊断的金标准。此外，艾滋病患者非结核分枝杆菌(non-tuberculosis Mycobacteria，NTM)的感染率和耐药率高，导致临床诊断和治疗更加复杂^[3]。本研究收集了广西某医院10年间艾滋病患者临床标本分枝杆菌培养及药敏试验结果并进行分析，以期为临床诊断、治疗及公共卫生预防提供参考。

1 材料和方法 1.1 材料来源

选取2010年1月—2019年12月于广西壮族自治区龙潭医院感染科住院或门诊就诊的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染/艾滋病患者作为研究对象，其主要来自柳州及周边地区，也有来自桂东、桂北、桂西地区者。收集患者临床标本进行分枝杆菌培养，共15 860人次，剔除重复病例及重复检测次数，共纳入13 795例。患者年龄18周岁以上，HIV抗体确认试验阳性，符合《中国艾滋病诊疗指南(2018年版)》的诊断标准^[4]。采集标本，主要为痰液(包括纤维支气管镜刷痰)、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)、粪便、尿液、脓液(用注射器抽取或脓肿切开引流)、分泌物(伤口表面或尿道口、阴道口、肛门等处，用干或湿棉签摄取)、胸水、腹水、关节液、淋巴结等活检组织、血液(包括骨髓)等。

1.2 方法 1.2.1 标本采集及送检要求

用无菌采样瓶留取晨痰标本。血液(包括骨髓)无菌采集后直接注入BacT/ALERT血培养瓶，其他类型的标本留于无菌容器中。各种标本采集后及时送检。

1.2.2 分枝杆菌培养

2010—2014年，分枝杆菌培养采用BacT/Alert 3D全自动微生物培养检测系统；2015—2019年采用MGIT 960液体培养法，同步进行中性改良罗氏培养。罗氏试剂由珠海贝索生物技术有限公司提供，BacT/Alert培养瓶及配套抗生素补充试剂由法国生物梅里埃公司提供，MGIT生长指示管及配套抗生素补充试剂由美国BD公司提供。痰液、BALF、粪便、尿液、脓液、分泌物、胸水、腹水、关节液及淋巴结等活检组织采用中和离心法进行前处理，取处理后的标本0.5 mL接种于加有抗生素补充试剂的BacT/Alert MP培养瓶(或MGIT生长指示管)，另取0.1 mL接种于中性改良罗氏培养基，脑脊液标本直接接种于培养基。严格按仪器操作说明书将接种好的BacT/Alert血培养瓶、BacT/Alert MP培养瓶(或MGIT管)放到BacT/Alert 3D 240或BACTEC^TM MGIT 960(美国BD公司)分枝杆菌培养系统中进行孵育，等待仪器自动报告结果。将接种好的中性改良罗氏培养基置于(36±1)℃恒温培养箱内孵育，接种第3天和第7天观察培养情况，以后每周1次，直至第8周末。固体或液体培养阳性菌株均经涂片抗酸染色确认。液体培养阳性菌株混匀后用注射器抽取0.1 mL转种于中性改良罗氏培养基。

1.2.3 菌种鉴定和药敏试验

以对硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培养基为鉴定培养基，对培养阳性的纯培养物进行初步菌种鉴定，用比例法进行药敏试验。鉴定和药敏试验培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供，培养基含药浓度分别为：PNB 500 μg/mL、噻吩-2-羧酸肼(thiophene-2-carboxylic acid hydrazide，TCH)5 μg/mL、异烟肼(isoniazide，INH)0.2 μg/mL、链霉素(streptomycin，SM)4 μg/mL、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)2 μg/mL、利福平(rifampin，RFP)40 μg/mL、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)2 μg/mL、对氨基水杨酸(p-amino-salicylic acid，PAS)1 μg/mL、卡那霉素(kanamycin，KM)30 μg/mL、丙硫异烟胺(prothionamide，PTO)40 μg/mL、卷曲霉素(capreomycin，CM)40 μg/mL。菌种鉴定、药敏试验及其质量控制均按照《结核病实验室检验规程》进行操作及结果判定^[5]

1.3 耐药性分类

结核分枝杆菌经体外药敏试验证实仅对1种一线抗结核药物耐药为单耐药(mono-resistance)，对1种以上一线抗结核药物耐药但不包括对INH和RFP同时耐药为多耐药(poly-resistance)，至少同时对INH和RFP耐药为耐多药(multidrug-resistance，MDR)，除同时耐INH和RFP外还对任何一种氟喹诺酮类和其他3种二线抗结核药物(CM、KM和阿米卡星)中的一种耐药为广泛耐药(extensive drug-resistance，XDR)。

1.4 统计学分析

采用Excel 2010软件建立数据库，SPSS 19.0软件进行统计学分析。正态计量资料以x±s表示，两组正态计量资料比较采用独立样本t检验、Pearson卡方检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 临床标本分枝杆菌培养结果

艾滋病患者临床标本分枝杆菌的总培养阳性率为15.68%(2 163/13 795)，前9年阳性率基本稳定，第10年明显下降，差异有统计学意义(χ²=107.266，P＜0.01，见表 1)。13 795例患者中，男性10 513例，女性3 282例，男女比例为3.2∶1，培养阳性率分别为16.57%(1 742/10 513)、12.83%(421/3 282)，差异有统计学意义(χ²=19.650，P＜0.01)。

2.2 分枝杆菌的菌种鉴定与分布

由于临床医师未能对所有分枝杆菌培养阳性者开具“分枝杆菌培养+菌种鉴定+药敏试验”检验单，因此仅对85.53%(1 850/2 163)的阳性菌株进行了菌种鉴定，分别为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和NTM，其中MTBC占77.95%(1 442/1 850)，NTM占22.05%(408/1 850)，详见表 2。结果显示，NTM占比15.71%~26.07%，波动较小，年间差异无统计学意义(χ²=10.442，P＞0.05)。

2.3 不同临床标本分枝杆菌培养结果

各临床标本分枝杆菌培养结果详见表 3，阳性率由高到低依次为脓液、分泌物、淋巴结等活检组织、胸水、腹水、BALF、痰液、尿液、粪便、脑脊液、血液或骨髓，差异有统计学意义(χ²=432.569，P＜0.01)。不同标本中MTBC与NTM分离率不尽相同，脑脊液、胸水、腹水、血液或骨髓、尿液、淋巴结等组织中NTM分离率低。

2.4 结核分枝杆菌耐药情况

1?偆b442株MTBC对常用一线和部分二线抗结核药物的总耐药率为23.30%(336/1 442)，单耐药情况详见表 4。10年来MTBC总耐药率年间差异有统计学意义(χ²=18.901，P=0.026)，对RFP(χ²=19.110，P=0.024)和OFX(χ²=20.684，P=0.010)的耐药率年间差异有统计学意义，而对INH(χ²=9.691，P=0.376)、SM(χ²=7.720，P=0.563)、EMB(χ²=7.570，P=0.560)、PAS(χ²=10.237，P=0.260)的耐药率年间差异无统计学意义。MTBC的多耐药率(χ²=5.157，P=0.822)和耐多药率(χ²=12.312，P=0.180)年间差异无统计学意义(见表 5)。2010—2012年MTBC对PTO的耐药率为0%~1.8%，2013—2019年MTBC对CM的耐药率为0%~1.6%。10年来MTBC耐药率由高到低依次为：INH、RFP、SM、OFX、EMB、PAS、KM。336株耐药MTBC来自336例患者，其中男性耐药率为23.67%(275/1 162)，女性耐药率为21.79%(61/280)，差异无统计学意义(χ²=0.446，P=0.504)。耐药者年龄分布如下：0~19岁占1.49%(5/336)，20~39岁占34.82%(117/336)，40~59岁占43.45%(146/336)，60~79岁占18.75%(63/336)，80岁及以上占1.49%(5/336)，其中20~59岁占78.27%(263/336)。

3 讨论

据世界卫生组织最新数据，截至2019年底估计全球有3 800万HIV感染者，当年新发HIV感染者170万例^[6]。《2019年全球结核病报告》^[7]显示，全球有活动性结核病患者1 000万人，其中8.6%为HIV抗体阳性，约25万例艾滋病相关死因由结核病引起。由此可见，全球的结核病和艾滋病形势严峻，特别是HIV/MTBC双重感染者预后差，病死率高。据报道^[8]，造成其死亡的危险因素有低CD4⁺T细胞、伴有其他机会性感染或基础性疾病、是否接受抗病毒治疗等，其中耐药结核病特别是耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的流行也是重要原因之一。因此，开展艾滋病患者分枝杆菌的培养、分离鉴定和耐药性检测是结核病和艾滋病防控工作中的一项重要内容，对临床诊治工作有重要指导意义。

据报道^[9]，广西近几年新发现HIV感染/艾滋病患者病例数逐年下降，但晚发现比例仍超过50%，某些年度新发现者中CD4⁺T细胞<200/mL的占90%以上，导致机会性感染疾病特别是结核病的发生率较高^[10]。由此可见，结核病是艾滋病患者的常见机会性感染，对HIV抗体阳性者进行结核病筛查非常重要。HIV抗体阴性患者的肺结核筛查主要依靠胸部X线片和痰涂片、痰培养，而艾滋病合并肺结核时胸部影像学改变往往不典型^[10]，且肺外结核多见，因此多种标本联合细菌检测是HIV/MTBC双重感染者结核病筛查的重要手段。本研究显示，HIV抗体阳性者分枝杆菌的总培养阳性率为15.68%。荟萃分析显示，中国大陆地区HIV感染和艾滋病患者中结核病患病率分别为7.2%和22.8%^[12]，以此估算HIV/MTBC双重感染者分枝杆菌培养的阳性率实际应高于15.68%。艾滋病合并结核病的临床表现与其免疫功能状态有关^[13]，CD4⁺T细胞计数较高者临床表现与普通结核病患者类似，而计数很低者常表现为肺外结核病，且易合并多个器官、系统结核。本研究显示，脓液、分泌物、淋巴结、胸水及腹水等肺以外部位的标本中MTBC分离率高，与HIV/MTBC双重感染的临床特点相符，即肺外结核多见。脓液与分泌物分枝杆菌培养阳性率高低可能与采集标本量的多少有关，脓液采集的标本量比分泌物多，培养阳性率高。10年来，HIV感染/艾滋病患者分枝杆菌培养阳性率似有下降趋势，这可能与早发现、早诊断导致结核病病情轻、菌阳肺结核患病率低有关，仅从本资料难以查证。

本研究中NTM的分离率为22.05%，高于2007—2008年全国结核病耐药性基线调查(3.4%)^[14]，与2010年全国第5次结核病流行病学抽样调查(22.87%)持平^[15]，且10年间波动较小，无增加趋势。有学者将HIV阳性与HIV阴性肺结核患者的痰标本进行分枝杆菌培养并对比分析，发现HIV阳性组NTM的分离率高达46.31%，而HIV阴性组仅3.50%^[16]，表明NTM已成为HIV感染/艾滋病患者机会性感染及死亡的重要病原体^[17]。然而，中枢神经系统、泌尿系统、血液系统、淋巴结、胸腹腔等部位NTM感染率相对较低，此类患者在疾病早期往往被误诊为肺结核，按结核病处理化疗效果不佳或标本培养并鉴定出NTM后才得到正确诊治。因此，对HIV感染/艾滋病患者抗结核治疗效果不佳时，应考虑NTM感染的可能，有条件者可采取快速鉴别NTM的方法，如基于分子生物学诊断技术的微阵列基因芯片法^[18]，及时指导临床用药。

本研究中MTBC分离株的总耐药率为23.30%，与文献报道的21.93%^[19]、25.85%^[20]基本一致，10年来其总耐药率及对RFP和OFX的耐药率年间差异有统计学意义，而单耐药率、多耐药率、耐多药率差异无统计学意义。MTBC的总耐药率在2018年最低(14.97%)，2015年最高(31.90%)，其他年份相差不大，比云南2012—2014年分离的MTBC总耐药率(48.89%)低^[20]。单耐药方面，MTBC对INH的耐药率最高，RFP次之。对常用一线和部分二线抗结核药物的耐药率从高至低依次是INH＞RFP＞SM＞OFX＞EMB＞PAS＞KM，与于海娟^[21]等报道的INH＞RFP＞OFX＞EMB＞SM＞KM稍有不同。MTBC对PTO、CM的耐药率均较低。

尼日利亚的一项研究^[22]对该国2016—2018年HIV感染者中425例疑似结核病患者进行分析，发现抗酸染色镜检阳性率为15.9%，其中15~34岁组阳性率最高(22.0%)；在分离出的分枝杆菌中，33.33%为MTBC，66.67%为NTM；对RFP耐药的MTBC占3.1%。其结果与本研究类似，但耐药率低于本研究。这表明HIV感染者中分枝杆菌感染极为常见，但不同地区和人群耐药状况存在差异，提示对其进行分枝杆菌筛查和耐药检测很重要。

MTBC耐药性与年龄之间的关系有不同报道，但低年龄是耐多药肺结核的危险因素，特别是20~59岁是耐药高发年龄段^[23]。本研究的耐药者中，20~59岁占78.27%，可能与此年龄段为性活跃期，是性传播感染HIV的主要人群有关。性别方面，男性耐药率是女性的4.5倍，与文献报道基本一致^[24]，可能与男性作为家庭主要劳动力、生活负担较重、服药依从性相对较差有关，但男女之间耐药率差异并不显著。

本研究历时10年，主要针对HIV阳性者各种临床标本的分枝杆菌培养结果进行分析，揭示菌种分布和耐药趋势，从而为临床诊治提供帮助。但受各条件影响，未能对所有培养阳性菌株进行菌种鉴定和药敏试验，不能全面反映广西HIV感染/艾滋病患者中分枝杆菌的耐药情况。此外，由于时间跨度大，结核病患者治疗登记信息不全，粗略查询登记表发现复治患者极少，加上国家结核病专报系统近几年才开始投入使用，所以无法系统全面地分析初治与复治患者的耐药情况，这些菌有待进一步研究。