2021, Vol. 16
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 201800
2. Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 201800, China
诺卡菌属(Nocardia)有90多个种，其中有54个种已报道与临床感染相关[1-2]，常见的致病菌包括星形诺卡菌(Nocardia asteroids)、巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、豚鼠诺卡菌(Nocardia otitidiscaviarum)、脓肿诺卡菌(Nocardia abscessus)、圣乔治教堂诺卡菌(Nocardia cyriacigeorgica)等。诺卡菌广泛分布于土壤、空气和腐败的植物中，可经呼吸道、皮肤软组织伤口或消化道进入人体，尽管诺卡菌病临床较为少见，但其能够对免疫力正常患者的伤口部位造成机会性感染，更易导致免疫力低下患者的局部或播散性化脓性感染[3]。近年来，随着免疫功能缺陷、血液系统疾病、器官移植术后使用免疫抑制剂、长期应用激素等患者的增多，诺卡菌病的发病率有所增长，70%~80%的诺卡菌病早期症状为肺部感染[4-5]。肺诺卡菌病无特异性的临床表现，容易误诊、漏诊，因此临床实验室的培养鉴定能力非常重要，若不能及时诊治，病死率较高。肺诺卡菌病的预后较差，病死率在41%左右[6]。诺卡菌进入肺部后还可能经血行播散导致全身脏器感染，甚至合并有脑脓肿、皮肤软组织感染等。
本文对上海市嘉定区中心医院2019年2月收治的1例由圣乔治教堂诺卡菌(Nocardia cyriacigeorgica)引起的肺诺卡菌感染病例进行分析，以提高临床实验室对圣乔治教堂诺卡菌的鉴定和药敏试验的重视，同时为临床医生诊治诺卡菌病提供更充分的理论依据，现报道如下。
1 病例资料 1.1 基本情况患者男性，77岁，2019年2月因“反复咳嗽咳痰，加重1周”入院。患者入院前曾多次出现反复咳嗽、咳痰、气喘症状，少量白色黏液痰。气候变化明显时或受凉后反复发作，每次急性发作病程累计超过3个月，曾到多家医院就诊，初步考虑为慢性阻塞性肺病，还曾住院抗感染治疗。既往高血压病史3年，最高血压150/95 mmHg。患者入我院1周前无明显诱因下出现气促加重，来院检查时肺部电子计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)平扫显示两肺见多发炎性病变，伴两肺下叶少许支气管扩张(见图 1A)。初步诊断为：慢性阻塞性肺病伴有急性加重、II型呼吸衰竭、高血压1级(中危组)、肺动脉栓塞。
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| A：2019年2月肺部CT平扫显示两肺多发炎性改变; B：2019年8月治疗后肺部CT平扫结果显示感染灶较之前明显吸收。 图 1 患者两次肺部CT平扫差异 Fig. 1 Difference of lung CT scan results before and after treatment in patients |
患者神志清醒，呼吸平稳，胸廓外形正常，无肋间隙增宽，双肺叩诊清音，双肺呼吸音粗，双下肺可闻及干啰音。心界叩诊无扩大，心率104次/分，律齐，无杂音，腹部平坦，无腹部压痛，无腹部反跳痛，双下肢轻度凹陷性水肿。神经系统未见明显异常。体温平稳，无发热，无头晕头痛，无心悸，无咳血，无腹胀等不适。
1.3 实验室检查血常规检查：白细胞(WBC)11.1×109/L，中性粒细胞百分比(NEU%)92.6%，淋巴细胞百分比(LYM%)3.2%，C反应蛋白(CRP)49.79 mg/L。血气分析结果显示，氧饱和度94.3%。凝血功能检测：凝血酶原时间20.5 s，凝血酶原活动度35.1%，纤维蛋白原浓度1.9 g/L，凝血酶时间22.0 s，D-二聚体3.18 mg/L。生化检测报告提示，总蛋白54.0 g/L，球蛋白19.0 g/L。
2 微生物学检查、鉴定及药敏试验 2.1 细菌培养患者入院后连续两次送检痰标本做一般细菌培养，接种在血琼脂平板、麦康凯平板和万古霉素巧克力平板(上海伊华公司)，置37 ℃、体积分数5% 的CO2环境中培养。2019年2月23日和27日两次送检的痰标本在37 ℃、5% CO2环境中培养2~3 d后观察，血平板上都出现了细小的、淡黄色、干燥的可疑菌落生长，菌落特征提示诺卡菌生长，纯化分离单个菌落后进行细菌鉴定和药敏试验。同时，对单个菌落进行涂片革兰染色、抗酸染色(珠海贝索生物技术有限公司生产)，革兰染色镜检为革兰阳性杆菌，抗酸染色菌体为蓝色，弱抗酸染色菌体为红色(见图 2)。纯化分离单个菌落培养5 d后，血平板上菌落形态为淡黄色、干燥、圆形、凸起的菌落，菌落有明显皱褶(见图 3)。
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| A.送检的痰标本; B.痰标本直接涂片后弱抗酸染色查见疑似诺卡菌(×1 000);C.血平板上培养3 d的诺卡菌细小菌落; D.圣乔治教堂诺卡菌革兰染色镜检结果(×1 000);E.圣乔治教堂诺卡菌抗酸染色镜检结果(×1 000);F.圣乔治教堂诺卡菌弱抗酸染色镜检结果(×1 000) 图 2 患者痰标本、圣乔治教堂诺卡菌培养及其染色结果 Fig. 2 Sputum specimens traits and Nocardia cyriacigeorgica and their staining results |
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| 图 3 圣乔治教堂诺卡菌培养5 d后的菌落形态 Fig. 3 Colony morphology of Nocardia cyriacigeorgica cultured for 5 days |
挑取血琼脂平板上的单菌落，加基质液后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析仪VITEK MS(法国生物梅里埃公司)进行鉴定，鉴定结果为圣乔治教堂诺卡菌(N. cyriacigeorgica)，鉴定率为99.9%。同时，使用安图生物有限公司的Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统进行检测，鉴定结果与VITEK MS结果相符，均为圣乔治教堂诺卡菌(N. cyriacigeorgica)，得分为9.53。
2.2.2 测序结果为了进一步证实鉴定结果的可靠性，同时对纯化分离后血平板上生长的单个菌落进行测序。参考文献鉴定方法，采用16S rRNA通用引物进行扩增[7]，将扩增产物送上海赛音生物科技有限公司进行测序。测序结果运用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库进行比对分析，鉴定结果为圣乔治教堂诺卡菌(N. cyriacigeorgica)，鉴定率为99.9%，与质谱鉴定结果一致。
2.3 药敏试验结果参考CLSI M45的要求进行药敏试验[2]，使用E-test药敏试验条进行检测。药敏结果显示(见图 4)：阿米卡星的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值为2 mg/mL，判断为敏感; 利奈唑胺的MIC值为>256 mg/mL，判断为耐药; 头孢他啶的MIC值为>32 mg/mL，判断为耐药; 环丙沙星的MIC值为>32 mg/mL，判断为耐药。
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| 图 4 利奈唑胺和阿米卡星的E-test药敏试验检测结果 Fig. 4 E-test susceptibility results of linezolid and amikacin |
患者首次入院完善相关检查后，医生结合临床诊断经验用药，予以头孢他啶联合左氧氟沙星进行抗感染治疗。茶碱缓释片、喘定、地塞米松、雾化解痉平喘; 氨溴索化痰; 螺内酯联合托拉塞米利尿等治疗10 d后，复查血常规提示白细胞较之前升高，患者气促较之前未见明显好转。根据患者状况，医生将抗感染治疗方案调整为哌拉西林他唑巴坦联合莫西沙星，进行抗感染治疗，同时送检痰标本做一般细菌培养。治疗2周后，患者仍然有气促症状。
考虑肺栓塞不能排除，完善肺动脉检查，结果提示双侧多发肺动脉栓塞，即刻予以告病危，心电监护，无创呼吸机辅助通气，使用华法林进行抗凝治疗。同时，结合临床实验室给出的痰培养细菌鉴定和药敏试验结果，再次调整治疗方案为复方新诺明、阿米卡星联合伊曲康唑进行抗感染治疗，1周后患者气促症状较之前明显好转，静息状态下无明显气促，一般状态可。2019年8月，患者经过治疗后复查肺部CT，平扫结果显示感染灶较2019年2月的CT结果有明显吸收(见图 1B)。
4 讨论诺卡菌广泛分布于自然界，是一类需氧放线菌，寄生于土壤腐物中，可在空气中形成菌丝体。大多数诺卡菌感染发生于免疫功能严重受损的患者，这些患者特别容易肺部感染和播散性感染，甚至通过血行播散或坏死性肺炎的连续播散导致肺外感染[3]。原发性皮肤和软组织诺卡菌病可由皮肤外伤引起，并与土壤污染有关。皮肤感染后，可发生浅表脓肿或局限性蜂窝组织炎[8]。复方新诺明是治疗各类诺卡菌病的首选药物[8]。
病原学检查是确诊诺卡菌病的重要依据，诺卡菌生长缓慢，培养周期长，一般需2~7 d，35 ℃培养48 h，才可见细小菌落生长[9]。本病例报道的患者因无明显诱因出现气促加重，并在就诊时肺部CT平扫提示两肺肺气肿，右肺中叶及左肺下叶纤维增殖灶，右肺下背段钙化灶。结合查体发现患者双肺呼吸异常，临床医生积极按照痰液涂片和痰液培养的要求申请并采集标本送检，大大提高了临床诺卡菌病的检出可能。同时，患者血常规检查提示白细胞、中性粒细胞百分比增高，C反应蛋白(CRP)异常，提示患者感染的可能性较大。连续多次送检晨痰进行涂片和培养，能够有效提高诺卡菌的临床检出率。实验室对诺卡菌的准确鉴定，尚须通过质谱鉴定或者分子测序来实现。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱可对诺卡菌属准确鉴定，不过仍然有一些种属未纳入数据库，还须进行测序鉴定。一项研究对222个测序确定的诺卡菌株进行了质谱检测，发现了18种不同的诺卡菌，部分诺卡菌在VITEK MS IVD V3.0数据库中是不存在的[9]。使用哥伦比亚琼脂+5%羊血(COS)培养基上的新鲜菌落，可以将质谱鉴定的准确率提高到91%。通过比较不同的前处理方式发现，直接涂布法的正确率较低，小于15%;而使用蛋白质提取法的正确率高，大于67%。采用3次重复的方法，可以获得最佳鉴别结果，达100%[9]。要准确进行耐药性检测，须及早、准确地鉴定到种，从而有效指导临床治疗，提高临床治疗效果[10]。研究表明，不同药物之间的药敏结果差异很大，但总体而言，相对于大多数药物，阿米卡星、利奈唑胺和复方新诺明具有良好的体外抗菌活性[1]。使用亚胺培南、阿米卡星、复方新诺明三联疗法，患者治疗效果良好，经静脉治疗30 d后出院[11]。但是，本报道中的圣乔治教堂诺卡菌对利奈唑胺、亚胺培南、环丙沙星、头孢他啶均耐药，但对阿米卡星敏感。结合文献推荐相关药物的使用[11]，以复方新诺明联合阿米卡星进行治疗，患者预后良好。
关于诺卡菌从皮肤、软组织感染到呼吸道和中枢神经系统感染，其流行病学特征包括种类分布、临床特征、药敏情况等。有学者从我国7个城市的8家三级综合医院收集到2009—2017年分离的53株诺卡菌，通过多位点序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)对这些分离株进行了鉴定，并对临床资料进行回顾性分析[12]。采用E-test药敏试验条测定诺卡菌对10种常用抗生素的敏感性，并分析了诺卡菌不同种对每种抗生素的耐药率。在53株诺卡菌中，最常见的是皮疽诺卡菌(N. farcinica)，占比24.5%(13/53)，其次是圣乔治教堂诺卡菌(N. cyriacigeorgica)，占比20.8%(11/53)，萜烯诺卡菌(N. terpenica)为15.1%(8/53)，脓肿诺卡菌(N.abscessus)为9.43%(5/53)，豚鼠诺卡菌(N.otitidiscaviarum)为7.55%(4/53)。尽管不同种类的诺卡菌对抗生素的敏感性差异很大，该研究中所有诺卡菌都对利奈唑胺敏感，其次是亚胺培南和阿米卡星(敏感率均为92.5%)。
通过E-test药敏试验条检测细菌敏感性以评估药物有效性的优势在于：①具有种类更齐全的抗菌药物; ②宽域的MIC值检测，每种单药物试条含15个MIC倍比稀释值; ③结果判读较于纸片法更加标准。本案例中，使用E-test药敏试验条测定发现，该株圣乔治教堂诺卡菌对利奈唑胺药敏结果为耐药，提示临床医生在治疗过程中更应该关注利奈唑胺耐药菌株出现的可能。本报道结果显示，E-test药敏试验条测定诺卡菌的药敏结果准确，对指导临床治疗和合理用药具有重要意义。但是，由于诺卡菌生长缓慢，药敏试验难以在不同级别的实验室常规开展[13]。因此，不同地区可组织多中心诺卡菌的临床和耐药特征分析，将有助于了解诺卡菌在不同地区分布的多样性，并为经验性治疗提供可靠的依据。
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