血流感染(bloodstream infection，BSI)是指包括细菌、真菌、病毒等在内的病原微生物进入血流而引起的全身血管播散性疾病^[1]。血流感染可导致菌血症、败血症、脓毒血症等一系列疾病，严重的可造成多器官功能衰竭、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)等，危及患者生命，因而成为临床诊断和治疗的一大难题^[2]。婴幼儿和儿童由于自身器官黏膜发育不完善，免疫系统尚未发育成熟，其血流感染特点与成人明显不同，作为机会性致病菌的凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylococcus，CoNS)等病原菌更易侵入血流造成感染^[3-4]，导致血流感染的诊断与鉴别更加困难。血培养是诊断血流感染的金标准^[5]，监测儿童血培养病原菌的构成及耐药情况对协助临床快速诊断和制订治疗措施具有十分重要的意义，因此本研究对上海市儿童医院2016—2018年血流感染患儿血培养病原菌的分布和耐药情况进行回顾性分析。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

收集上海市儿童医院2016—2018年住院患儿血培养分离菌株，并剔除分离自同一病例的重复菌株。综合分析患者临床资料和实验室数据以鉴别CoNS为致病菌或污染菌：入院48 h内血培养阳性和多次血培养为同一细菌，考虑可能为致病菌；入院3 d以上血培养阳性或多次血培养阳性但属不同种CoNS判定为污染菌^[6]。

1.1.2 纳入标准

判断CoNS血流感染的标准^[7]为至少符合以下1项。①有败血症临床表现，各实验室指标阳性，初次血培养阳性标本采集时体温≥38 ℃或 < 36 ℃，低血压。②患儿一次或多次血培养同时分离到同种CoNS。③≥2次血培养阳性且培养出相同菌种，耐药谱亦相同，抗菌药物治疗有效。④≤1岁患儿具备以下至少1项症状或体征：发热，寒战，呼吸急促或暂停，脉搏徐缓，实验室指标阳性[外周血白细胞(white blood cell，WBC)计数增多或降低，或中性粒细胞增多或核左移，或C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)增高，或降钙素原(procalcitonin，PCT)增高]。

判断CoNS血流污染的标准^[8]为至少符合以下1项：①无明显发热或发热可由其他原因解释(如肿瘤、侵袭性操作、免疫性疾病等)，且无明显感染征象或实验室检查结果不支持；②由其他已知病原体引起的血流感染；③使用菌株敏感抗菌药物治疗无效；④连续多次多日分离出2种以上皮肤正常菌群；⑤CoNS阳性标本于72 h内又分离到另一细菌或真菌，但未分离到CoNS。

1.1.3 实验仪器

采用法国梅里埃公司BACT/ALERT 3D 240全自动血培养仪进行细菌培养，采用法国梅里埃公司VITEK MS质谱检测仪和VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行药敏试验。

1.1.4 培养基

血琼脂培养基、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板、M-H琼脂平板购自上海伊华生物技术有限公司。

1.1.5 抗菌药物纸片和E-test药敏条

抗菌药物纸片购自英国OXOID公司，青霉素、万古霉素、替加环素E-test药敏条购自法国梅里埃公司。

1.2 方法 1.2.1 细菌药敏试验

参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的药敏试验标准，采用仪器或纸片扩散法进行药敏试验，结果判读参考M100-S28文件^[9]。质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 25923、ATCC29213)、大肠埃希菌(ATCC25922、ATCC35218)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、粪肠球菌(ATCC29212)，由上海市临床检验中心提供。

1.2.2 统计学分析

采用WHONET 5.6软件对药敏结果进行统计分析，其他数据采用SPSS22.0软件进行统计分析，两独立样本比较采用Mann-Whitney U检验，多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验，P < 0.05代表差异有统计学意义。

2 结果 2.1 细菌分布

从24 687例儿童患者血培养标本中共分离到2 092株非重复菌株，检出率为8.5%。其中革兰阳性菌为1 766株(84.4%)，革兰阴性菌326株(15.6%)。革兰阳性菌主要包括CoNS 1 433株(68.5%)、肠球菌属149株(7.1%)、链球菌属94株(4.5%)、金黄色葡萄球菌68株(3.3%)。肠球菌属包括粪肠球菌69株、屎肠球菌61株、铅黄肠球菌8株及其他11株。链球菌属包括无乳链球菌44株、肺炎链球菌18株、化脓链球菌2株、草绿色链球菌30株。革兰阴性菌主要包括肺炎克雷伯菌104株(5.0%)、大肠埃希菌87株(4.2%)、铜绿假单胞菌24株(1.1%)、鲍曼不动杆菌22株(1.1%)。3年间检出率居于首位的一直是CoNS，占60%以上，其中表皮葡萄球菌和人葡萄球菌检出率最高，分别占30.3%和27.2%。3年中患儿血培养病原菌的种类及构成比如表 1所示。

2 092株菌株中，阳性检出率最高的是新生儿科722株(34.5%)，其次是呼吸科425株(20.3%)、重症监护室236株(11.3%)、血液科166株(7.9%)、儿科病房102株(4.9%)、消化科121株(5.8%)、心内科70株(3.3%)等。其中新生儿科、呼吸科、重症监护室的检出菌以CoNS为主，血培养阳性菌占60%以上。

2.2 CoNS培养阳性患儿的PCT、CRP和WBC水平

3年间PCT(H=47.90, P < 0.000 1)和CRP(H=11.77, P=0.002 8)水平有统计学差异，WBC水平无统计学差异(H=4.814，P>0.05)。CoNS阳性患儿的临床炎症指标如表 2所示。

2.3 主要革兰阳性菌对常用抗菌药物的耐药情况

1 766株革兰阳性菌中，CoNS占比最高，为81.1%(1 433/1 766)，其次为肠球菌8.4%(149/1 766)、金黄色葡萄球菌3.9%(68/1 766)。3年间耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococcus，MRCoNS) 的检出率分别为66.0%、73.7%和65.4%。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的检出率呈逐年上升趋势，分别为36.4%、37.5%和45.5%。MRSA和MRCoNS对红霉素、克林霉素、庆大霉素、左氧氟沙星的耐药率显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)和甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-sensitive coagulase-negative Staphylococcus，MSCoNS)，未检出对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌。屎肠球菌对氨苄西林、左氧氟沙星、高浓度庆大霉素的耐药率均高于粪肠球菌，未检出对万古霉素和利奈唑胺耐药的肠球菌。耐药情况具体如表 3~5所示。

2.4 主要革兰阴性菌对常用抗菌药物的耐药情况

326株革兰阴性菌中，占比最高的是肺炎克雷伯菌(31.9%)，其次是大肠埃希菌(26.7%)、铜绿假单胞菌(7.4%)和鲍曼不动杆菌(6.7%)。

肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药率明显高于大肠埃希菌，对第2、3代头孢菌素的耐药率高达80%左右；对碳青霉烯类的耐药率呈上升趋势，2018年高达62.5%，差异具有统计学意义(P < 0.05)。大肠埃希菌对碳青霉烯类仍具有较高的敏感性，2016—2017年未分离出对碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌，而2018年其对碳青霉烯类的耐药率为7.1%。铜绿假单胞菌对测试用抗菌药物的敏感性较高，对碳青霉烯类的耐药率低于10%。

鲍曼不动杆菌的耐药现象较为严重，对第3代头孢菌素、氨基糖苷类和碳青霉烯类的耐药率均在60%以上。具体数据如表 6所示。

3 讨论

本研究共分离获得血培养阳性病原菌2 092株，革兰阳性菌占84.4%，其中分离率居首的是CoNS(68.5%)，与侯宏等^[10]的报道一致。CoNS是人类和动物皮肤黏膜的正常菌群，但近年来其作为条件致病菌的检出率呈上升趋势^[11-12]。儿童尤其是新生儿由于皮肤黏膜发育不完善，免疫系统尚未发育成熟，导致CoNS更易成为机会性致病菌侵入血流^[13]，这也是本研究中新生儿科CoNS分离率较高的原因，与国内其他儿童血流感染相关报道的结论一致^[14-15]。

CoNS作为正常菌群大量存在于周围环境和皮肤黏膜表面，消毒不彻底或抽血时间过长等都可导致血培养污染，有文献报道其污染率高达80%以上^[16]。因此，临床医师须结合WBC、PCT、CRP等感染指标和血培养报阳时间，以及是否双侧阳性等指标，综合评价来区分致病菌和污染菌^[17-19]。研究表明，当革兰阳性菌的报警时间≤20.96 h可提示为血流感染^[20]。本研究中CoNS的平均报阳时间为(32.53±12.36)h，高于黄磊等^[21]的报道，双侧阳性组与单侧阳性组的平均报阳时间无显著差异。研究表明，WBC、CRP、PCT等指标可辅助血流感染的诊断，其中PCT的诊断效能最高^[22]，且PCT水平在不同菌种导致的血流感染之间存在显著差异，而CRP和WBC水平在不同菌种导致的血流感染之间无显著差异^[23]。彭胡等^[22]的研究指出，PCT>0.5 ng/mL时诊断血流感染的阳性预测值达95.5%，CRP>60 mg/L时阳性预测值为54.49%，WBC>12×10⁹/L时阳性预测值为46.23%。本研究中，CoNS阳性血流感染患儿的PCT平均水平为(0.98±3.03)ng/mL，CRP为(22.88±33.95)mg/L，WBC为(11.18±14.82)×10⁹/L，其中PCT水平高于罗雪平和袁南贵^[24]的研究，而WBC和CRP水平低于既有研究^{[22, 24]}。

金黄色葡萄球菌是血流感染的常见病原菌之一，分离率达20%~35%^[25]。研究表明，金黄色葡萄球菌所致血流感染的发生率在成人中较高，且一半以上与MRSA有关，耐药严重^[25]。本研究中金黄葡萄球菌对青霉素的耐药率达80%以上，尚未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的菌株。但近年来随着万古霉素的广泛使用，其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)有升高的趋势^[26]，因此临床要规范万古霉素的使用，避免耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)的出现。肠球菌中屎肠球菌对氨苄西林、左氧氟沙星的耐药率高达85%以上，显著高于粪肠球菌，尚未发现耐万古霉素和利奈唑胺的菌株，但已有从血流感染患儿体内分离到耐万古霉素肠球菌的报道^[27-28]，因此临床应引起重视。

革兰阴性菌中排名前2位的是肺炎克雷伯杆菌和大肠埃希菌，对氨苄西林、头孢菌素类耐药明显，对喹诺酮类较为敏感，可能与儿科广泛使用青霉素类及头孢菌素类而极少使用喹诺酮类药物有关。碳青霉烯类通常被认为是治疗肠杆菌科细菌感染尤其是产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase，ESBL)细菌感染的最后一道防线，但近年来其耐药率呈升高趋势，给临床抗感染治疗带来了巨大的困扰。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类最主要的耐药机制是产生KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)型碳青霉烯酶或NDM-1(New Delhi metallo- β -lactamase-1)型金属酶，不同地区和不同人群来源的菌株耐药机制则有所不同，成人以产KPC-2型为主，儿童以产NDM-1型为主，主要在新生儿中引起播散流行^[29-30]。血培养分离的非发酵菌以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为主。铜绿假单胞菌对测试用抗菌药物的敏感率在90%以上。鲍曼不动杆菌的耐药现象严重，对第3代头孢菌素、氨基糖苷类和碳青霉烯类的耐药率均在60%以上，且2018年血培养分离的鲍曼不动杆菌均为泛耐药鲍曼不动杆菌(extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii，XDR-AB)，临床和感染控制部门应对此重视，合理使用抗菌药物。

综上所述，2016—2018年上海地区儿童血流感染病原菌以CoNS为主。对于新生儿及儿童这类特殊群体，鉴别CoNS是否为病原菌至关重要，临床医师可结合CRP、PCT与阳性报警时间等指标协助早期和快速诊断。此外，由于儿童群体的特殊性，其血流感染病原菌种类复杂，耐药谱也在不断地变化，多重耐药菌株的出现给抗感染治疗带来了极大的困难。因此，定期监测血培养病原菌的种类和耐药性有助于血流感染的快速诊断，从而指导临床合理用药，减少耐药菌的出现。