2022, Vol. 17
2. 海南省三亚市人民医院眼科, 海南 三亚 572000
2. Department of Ophthalmology, Sanya People's Hospital, Sanya 572000, Hainan Province, China
可可毛色二孢广泛存在于自然界中，主要引起受感染植物寄主[1]的“腐烂”和“枯死”。迄今为止的病例报告主要来自热带或亚热带地区，多数涉及眼部感染[2]和创伤/接触等引起的皮肤(或指甲)感染[3]。目前国内针对可可毛色二孢的感染病例报道较少见，本文对1例角膜溃疡患者感染可可毛色二孢进行病例分析。
1 病例资料 1.1 病例患者男，广西籍，常住广西东兰县，农民，54岁，发病前在海南省三亚市天涯镇南山区农场务农。2021年6月15日，患者在杧果园劳作时不慎被树枝划伤右眼，当时稍有疼痛不适，未做任何处理。3 d后右眼发红，疼痛加重，在当地医院治疗(静脉给予抗炎药物，局部给予滴眼液治疗，具体不详)，效果欠佳。患者于2021年6月29日来我院眼科门诊就诊，门诊拟“右眼严重角膜溃疡”收住院治疗。患者起病以来食欲、睡眠、大小便正常，精神状态好。既往史：否认“肝炎、结核、糖尿病、高血压”等其他疾病病史，无食物或药物过敏史。
主要血液学检查指标如下：白细胞计数14.45×109/L，中性粒细胞比率84.8%，淋巴细胞比率10.9%，C反应蛋白为0.06 mg/L；血糖4.31 mmol/L，丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)值36U/L，肌酐为59 μmol/L，尿素3.93 mmol/L，总蛋白65.6 g/L，白蛋白39.7 g/L，球蛋白25.9 g/L。输血4项(乙型肝炎、梅毒、丙型肝炎、艾滋病)指标未见异常。
入院诊断：(1)右眼角膜溃疡(严重)；(2)右眼眼内炎；(3)右眼前房积脓。患者住院期间临床症状和治疗情况见表 1。
| 日期 | 主要临床体征 | 主要治疗方案/转归 |
| 2021-06-29 | 右眼Vod有光感；眼压测不出；眼睑、泪道、泪囊区无殊；球结膜混合充血(++)，角膜全层灰白色浑浊，呈地图状面不平，前房下方可见淡白色沉积，余眼内情况窥不清。左眼Vos为0.6；眼压18 mmHg；余无殊 | 全身给予头孢孟多酯钠2 g静滴q12h；地塞米松10 mg静滴，qd；局部滴眼药物(妥布霉素滴眼液1~2滴，q6h) |
| 2021-06-30 | 右眼Vod有光感；眼压测不出；余无殊；球结膜混合充血(++)，结膜囊少许白色拉丝状分泌物，角膜全层灰白色浑浊，呈地图状溃烂，表面不平，前房下方可见淡白色沉积(见图 1)，余眼内情况窥不清。左眼检查同前 | 停用头孢孟多酯、地塞米松静滴治疗；停用妥布霉素滴眼液治疗；右眼使用氟康唑滴眼液1~2滴，q2h；氟康唑氯化钠注射液0.4 g静滴，qd |
| 2021-07-01 | 同上 | 同上 |
| 2021-07-02 | 右眼角膜全层灰白色浑浊，呈地图状溃烂表面不平达基质层，余同前 | 同上 |
| 2021-07-03 | 右眼球结膜混合充血(++)，水肿(+)，余同前 | 同上 |
| 2021-07-04 | 同上 | 治疗未见好转，患者及家属要求出院，无法继续追踪后续治疗 |
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| Red arrow: grayish-white pus in the anterior chamber. Green arrow: grayish-white infiltration. 图 1 裂隙灯下角膜及前房变化 Fig. 1 Changes of cornea and anterior chamber under slit lamp |
荧光染液购于国为生物科技泰州有限公司，一次性封闭真菌形态学观察培养基、沙氏葡萄糖琼脂(sabouraud dextrose agar，SDA)平板培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)平板培养基购于珠海美华医疗。药敏试验的试剂购于温州市康泰生物科技有限公司。
1.2.2 荧光显微镜观察角膜刮取物将角膜刮取物置于干净玻片上，再滴加1滴荧光染液，用盖玻片轻轻按压，置于荧光显微镜下观察。
1.2.3 角膜刮取物的培养及观察取角膜刮取物接种在SDA平板培养基上，1 d后将长出的绒毛样菌落转种于PDA平板培养基。通过点种的方式，将PDA平板培养基分别置于室温23 ℃、湿度74%的生物安全柜和温度28 ℃、湿度57%的培养箱里同时培养，观察培养物的生长变化情况。将培养3 d得到的培养物点种于一次性小培养皿上方，放置于28 ℃、湿度57%的培养箱中再培养3天，显微镜下观察培养物的形态。PDA平板培养21 d后，取一小块培养基上的分生孢子座置于玻片上，通过压片方式将其压碎，加入棉蓝染色后置于显微镜下观察。
1.2.4 药敏试验临床实践中，丝状真菌的体外药敏试验方法主要包括美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的M38-A肉汤稀释法、琼脂扩散法和E-test法。琼脂扩散法仅限于定性，目前较少使用。由于该病原菌产孢时间长，孢子量少，故采用M38-A推荐的产孢丝状真菌药敏试验所得到的结果判读效果不好。根据该病原菌菌丝生长快的特点，目前理想的检测方法是用菌丝做药敏试验，采用E-test法(又称浓度梯度法)进行药敏试验，具体操作如下：①使用前将药敏试验纸条从冰箱中取出，恢复至室温；②用无菌咽拭子蘸取生理盐水，从培养3 d的PDA培养基的菌落中挑取菌丝放置于灭菌后的EP管中，EP管里放置玻璃珠和生理盐水，用直止血钳搅碎菌丝，振荡，重复数次，用生理盐水调整菌液浓度至0.5~1麦氏浊度，静置5分钟后进行比浊；③将菌液均匀涂布于药敏培养基上，不同角度涂抹3次，然后沿平皿内缘涂抹一圈，盖上皿盖，置于室温干燥3~5 min，用镊子夹取试纸条直插入培养基；④将平皿置于35 ℃培养箱内，观察药敏试验结果。试验所用生理盐水、止血钳和玻璃珠均提前进行高压灭菌。
2 结果 2.1 角膜刮取物荧光染色后镜下可见菌丝在紫外光的背景下可见菌丝粗细均匀，两边平行，菌丝中间可见亮白色的隔(见图 2)。
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| 图 2 角膜刮取物荧光染色镜检(400×) Fig. 2 Microscopy of corneal scrapers after fluorescent staining (400× magnification) |
置于生物安全柜和28 ℃培养箱中培养的PDA平板，均在第1天即有培养物开始生长，培养基正面可见白色绒毛状菌落，第3天整个培养基正面布满菌落，第7天整个培养基背面全部转为黑色。置于生物安全柜中的平板在培养14 d后出现分生孢子座，分生孢子位于分生孢子座中(见图 3A~3D)。而置于28 ℃培养箱中的平板在第21天出现分生孢子座。取一小块分生孢子座置于玻片上，通过压片方式，将分生孢子座压碎后加入棉蓝染色，在显微镜下可找到分生孢子。分生孢子呈椭圆形或卵圆形，壁厚，其有2种类型：不成熟时呈无色透明状，经棉蓝染色后呈蓝色，单胞；成熟后变棕色至黑色，具有纵纹、厚壁、双胞等特点(见图 4A~4B)。
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| A: Corneal scrapers were cultured for 1 day. B: Corneal scrapers were cultured for 3 days. C: Corneal scrapers were cultured for 7 days. D: Corneal scrapers were cultured for 14 days, sporodochium can be observed (red arrows). 图 3 角膜刮取物培养菌落形态 Fig. 3 Colony morphology of corneal scraping culture |
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| A: Sporodochidium. B: Conidia stained by cotton blue. 图 4 分生孢子座及分生孢子棉蓝染色(400×) Fig. 4 Sporodochidium and conidia stained by cotton blue (400× magnification) |
培养3 d后，小培养基上菌落生长较快，布满整个小培养皿。显微镜下可见大量菌丝，未见孢子(见图 5)。
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| 图 5 小培养后显微镜下可见大量菌丝(400×) Fig. 5 A large amount of hyphae observed under the microscope after small culture (400× magnification) |
培养菌落经高温灭活后，由北京睿博兴科生物技术有限公司提取菌落DNA，使用通用引物ITS1和ITS4进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增和测序。基因扩增后电泳可见单一清晰目的条带，测序结果经NCBI-BLAST网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对显示，扩增产物与Lasiodiplodia theobromae(MK530067.1)序列的相似度为99.81%，确定病原菌为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。
附序列：Seq：>ITS-1817.15750086
CTTCCGTAGGGGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTTTTCGAGCTCCGGCTCGACTCTCCCACCCTTTGTGAACGTACCTCTGTTGCTTTGGCGGCTCCGGCCGCCAAAGGACCTTCAAACTCCAGTCAGTAAACGCAGACGTCTGATAAACAAGTTAATAAACTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGCTCTGCTTGGAATTGGGCACCGTCCTCACTGCGGACGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCTGTTCAGCCCTCAAGCGTAGTAGAATACACCTCGCTTTGGAGCGGTTGGCGTCGCCCGCCGGACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGAA。
2.5 体外抗真菌药敏试验提示伏立康唑敏感判读结果要求：两性霉素B的判读终点为生长被完全抑制处，5-氟胞嘧啶的判读终点为95%菌被抑制处；唑类等其他药物的判读终点为80%菌被抑制处。质控菌株为近平滑念珠菌(ATCC22019)。如表 2所示，伏立康唑的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为0.125 μg/mL，两性霉素B的MIC为2 μg/mL，其余抗真菌药物的MIC均高于32 μg/mL。
| 抗真菌药 | MIC(μg/mL) |
| 两性霉素B | 2.000 |
| 氟康唑 | >256.000 |
| 泊沙康唑 | >32.000 |
| 米卡芬净 | >32.000 |
| 5-氟胞嘧啶 | >128.000 |
| 伊曲康唑 | >32.000 |
| 酮康唑 | >32.000 |
| 伏立康唑 | 0.125 |
真菌性角膜溃疡是一种全球感染性疾病，致盲率极高，治疗难度较大[4]。在以农业收入为主要经济来源的地区，患者多来自从事农业劳动的人群，发病原因为角膜受到真菌的直接侵染。由于我国是农业大国，真菌性角膜炎的发生率极高。随着DNA测序技术的临床应用，越来越多的致病真菌被发现[5]。
可可毛色二孢菌属子囊菌门、盘菌亚门、座囊菌纲、葡萄座腔菌目、葡萄座腔菌科、葡萄座腔菌属、葡萄座腔菌的无性态，它首先由Saccardo于1890年从厄瓜多尔腐烂的可可豆上分离[6]。可可毛色二孢广泛分布于热带和亚热带地区，主要存在于土壤和植物中，并能导致大田作物、蔬菜、水果和林木等多种植物产生病害。L. theobromae引起的植物病害主要有梢枯、枝枯、根腐、果腐、叶斑、溃疡、流胶、变色、坏死和鬼帚病等[7]。
本病例中，患者在杧果地劳作的过程中不慎被树枝划伤右眼。肖倩莼等[8]报道，杧果枝枯病为真菌性病害，主要危害集中在枝条和茎干，病原菌多为可可毛色二孢。患者感染症状加重可能原因为真菌毒素引起的角膜炎症反应，角膜上皮细胞受损，真菌孢子与之发生黏附，引发角膜上皮基底膜和基质胶原成分降解破坏[9]，加之患者使用抗生素和激素类药物治疗后局部免疫力低下，导致病情加重。
可可毛色二孢的适宜生长温度为20~45 ℃，低于15 ℃不能生长，生长pH值为2.5~11.7，以5.5最合适，pH值为3~4时有利于病原菌分生孢子产生。可可毛色二孢能够有效利用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等14种供试碳源，其中葡萄糖为最佳碳源。该菌还可利用DL-丙氨酸、硝酸钠、DL-甲硫氨酸等10种供试氮源，以DL-丙氨酸最适合。可可毛色二孢菌丝体的致死温度为52 ℃，其分生孢子的致死温度为53 ℃[10]。据文献报道[11-13]，病原菌的产孢能力与环境温度、湿度相关；而且，同一病原菌寄生在不同的植物上，其产孢所需的温度、湿度不同，产孢的时间长短亦不同，说明不同寄生宿主对其生物学特性也有影响。本例中的可可毛色二孢在白炽灯光照环境下，将其转种的PDA平板培养基分别置于室温23 ℃、湿度74%的生物安全柜和温度28 ℃、湿度57%的培养箱里同时培养，培养14天后，置于生物安全柜内的PDA平板培养基中有分生孢子座产生，分生孢子位于分生孢子座里，提示生物安全柜内的环境条件比培养箱中的条件更容易产孢。
由于目前临床上仍然没有治疗真菌性角膜溃疡的理想药物，故其治疗难度较大。患者对氟康唑治疗无效或治疗效果不佳，应当考虑氟康唑耐药，由于不同真菌对药物治疗的敏感程度不同，经验用药要根据菌种选择。Rebell等[9]研究发现，7株可可毛色二孢体外药敏试验提示外用两性霉素B对该菌有良好的治疗效果。此外，可可毛色二孢的眼部分离株在体外对咪康唑、酮康唑、伊曲康唑、益康唑和那他霉素[14]等多种抗真菌药物具有耐药性。Radford等[15]研究发现，伏立康唑对可可毛色二孢具有良好的体外活性，这与本例中可可毛色二孢的体外药敏试验结果相一致，即对大多数抗真菌药物耐药的真菌，对两性霉素B和伏立康唑相对敏感。
可可毛色二孢感染属于新发感染，多发生于热带或亚热带地区，国内报道病例较少。目前对于治疗真菌性角膜溃疡没有理想的药物。患者临床表现、样本培养特性、镜下形态观察、药敏试验、基因测序等多方面的资料能够为临床诊断、鉴别诊断及治疗提供一定的参考依据，从药敏试验结果来看，可可毛色二孢对两性霉素B和伏立康唑相对敏感，本研究结果可为类似患者的早期治疗提供参考。
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