2023, Vol. 18
据世界卫生组织的最新统计，至2019年，全世界约有2.96亿人患有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，每年新增乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染约150万例，由HBV相关疾病导致的死亡约82万例[1]。肝内持续存在的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是乙型肝炎(简称乙肝)慢性化的重要原因[2-4]，目前的治疗药物如核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues，NA)、聚乙二醇干扰素α (peginterferon α, PEG-IFN α)等无法彻底清除cccDNA，HBV感染难以被彻底治愈。因此，目前国内外均以长期抑制HBV复制，减轻肝细胞炎症坏死，降低肝纤维化、肝硬化、肝癌风险，从而改善临床结局和生活质量为CHB抗病毒治疗的主要目标[5]。因而选择合适的监测指标，准确评估CHB患者当前的病毒复制与转录情况，评价药物疗效及预后，对选择治疗方案、确定治疗起点与终点有着重要意义。肝脏穿刺是目前检测肝内cccDNA和总HBV DNA最精确的手段，并可直接反映肝脏的炎症状态，但为有创性操作，且可能存在样本误差，没有统一的标准化检验手段，对许多发展中国家而言价格也较为昂贵，不利于推广[3, 6]，因而迫切需要简便易行的血清标志物作为替代。目前常用的乙肝血清标志物包括HBV DNA、HBsAg等，但在NA经治患者中，血清HBV DNA常低于检测下限，限制了其临床应用[7]，而HBsAg可来源于整合HBV DNA而无法如实反映cccDNA水平，且存在受基因型影响大等不足[8]。乙肝核心相关抗原(Hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)作为新近发现的血清标志物，克服了上述缺点，在监测和评估慢性乙肝患者预后中有着重要的临床应用价值。下面将从HBcrAg的分子生物学基础、检测手段及临床应用等方面进行系统阐释。
1 HBcrAg的分子生物学基础HBcrAg包括乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)、乙肝e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和p22cr三部分。HBcAg由前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)翻译而来，N端区(N-terminal domain，NTD)与C端区(C-terminal domain，CTD)通过连接区(linker)相连接(见图 1)。HBeAg和p22cr均由前核心区mRNA(precore mRNA)翻译修饰而来(见图 1)。precore mRNA直接翻译产物p25较于HBcAg在N末端多了29个氨基酸(amino acid，aa)，在内质网中去除N末端19aa的疏水肽段形成p22，p22在后续的分泌过程中由蛋白酶在不同的氨基酸残基位点进行催化裂解，从而形成不同长度的C末端，即为不同长度的HBeAg，裂解位点通常在149位氨基酸以后。相关研究发现，非A基因型的HBeAg通常在第1个RXXR(151RRDR154)序列处进行裂解[9]。而A基因型的HBeAg相比其他基因型在C末端多插入了2个氨基酸残基(153DR154)，蛋白酶裂解位点常由第1个RXXR变为第2个或第3个，因而产生的HBeAg序列更长[9-10]。p22cr亦是p25来源的分子量为22 kDa的蛋白，在加工过程中保留了N末端的信号肽，但去除了-29位蛋氨酸，-28位谷氨酸(Glutamic acid，Glu)发生乙酰化(Acetylation)，C末端的加工则与HBeAg相似。p22cr在2005年被发现，并被认为是组成HBV空病毒颗粒中衣壳的主要成分[11]。然而最近有研究表明，无论是完整病毒颗粒还是空病毒颗粒，其中的衣壳基本由HBcAg组成，precore来源的蛋白(HBeAg、p22cr)即使参与核衣壳的组成也仅占极少部分[10]。目前对HBcrAg各组分及其功能的基础研究还未完全清晰，有待进一步的探索。
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| Note: pgRNA (pregenomic RNA), HBcrAg (Hepatitis B core-related antigen), Glu (Glutamic acid). 图 1 HBcrAg的分子生物学基础 Fig. 1 Molecular basis of HBcrAg |
最早的HBcrAg检测由Kimura等[11-12]在2002年提出，由于三者有149个相同的氨基酸残基序列，因此针对这一序列的单克隆抗体可同时检测这3种抗原。用含十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)、吐温60(Tween60)等去垢剂的预处理液对血清标本进行预处理，有利于释放病毒颗粒内及与抗体结合的HBcrAg，暴露抗原表位从而被检测。HBcrAg的检测依靠化学发光酶联免疫法，以大肠杆菌表达的重组前体HBeAg(rpro-HBeAg)为标准，与10 fg/mL rpro-HBeAg相对应的HBcrAg检测荧光强度被定义为1 U/mL。目前通过Lumipulse G1200 CLEIA analyser (Fujirebio, Tokyo, Japan)可实现HBcrAg的自动化检测，检测下限为2.0 log U/mL，线性检测范围(即定量范围)为3.0 log U/mL~7.0 log U/mL[12-13]。最近Inoue等[14]提出了一种新的高敏感性检测方法iTACT-HBcrAg。通过在预处理液中加入还原剂改变HBcrAg的分子构型，暴露新的抗原表位，从而增强免疫反应性，提高检测灵敏度。通过对梯度稀释的HBcrAg阳性血清及阴性血清的检测发现，iTACT检测的定量下限为2.1 log U/mL，优于Lumipulse G1200 CLEIA analyser的定量下限(3.0 log U/mL)。但这一方法的可靠性仍有待进一步验证。若确能提高检测灵敏度，HBcrAg的应用范围将扩大，其应用价值也将得到提升。
3 HBcrAg与肝脏内cccDNA水平及转录活性的相关性作为病毒复制和转录的模板，肝细胞核内cccDNA的持续存在是HBV慢性感染的重要原因[4]，因此cccDNA水平及其转录活性是评估慢性乙肝患者病情和疗效的重要指标。如前所述，肝脏穿刺由于诸多限制不利于推广，因此需要相对无创的血清标志物来评估患者的cccDNA水平和转录活性。目前临床常用的乙肝血清标志物包括HBV DNA、HBsAg等。在NA经治患者中，血清HBV DNA显著下降，常常低于检测下限，而cccDNA未见明显减少，因此在此类患者中二者的相关性较差[7]。而HBsAg在不同的研究中与cccDNA水平的相关性不一，且除了cccDNA以外，HBsAg还可来源于整合HBV DNA，尤其在低病毒载量患者中更为明显[8]，因此亦无法如实反映cccDNA水平及其转录活性。
已有多项研究表明，HBcrAg与肝内cccDNA呈明显正相关，虽然各研究的相关系数不尽相同，但大多高于cccDNA与血清HBV DNA、HBsAg等其他HBV标志物的相关性。2017年Wong等[15]的研究纳入了138例NA经治患者，发现在130例血清HBV DNA低于检测下限的样本中，101例(78%)仍可检测到HBcrAg，与cccDNA的水平呈正相关。并且在超过6年的NA长期治疗中，HBcrAg下降的中位对数值与cccDNA较为同步。这提示HBcrAg可作为NA治疗后血清HBV DNA低于检测下限的病人的潜在监测指标。来自法国的研究团队发现，在HBeAg阴性且未经治疗的患者中，HBcrAg阳性患者较于HBcrAg阴性患者其肝内pgRNA及pgRNA/cccDNA的水平更高[16]。来自日本的一项研究也表明，在NA经治患者中，HBcrAg阳性与HBcrAg阴性患者相比，cccDNA水平未见明显差异，但有更高水平的pgRNA、pre-S/S RNA和HBx RNA[17]。以上研究提示：HBcrAg水平可能与肝内cccDNA的转录水平有关。
然而，也有部分研究提示HBcrAg与cccDNA的水平相关性差，且受不同自然史时期及药物治疗的影响大，而HBcrAg与cccDNA转录水平的研究则较少，因此未来还需要更大样本及更细化的队列研究进一步探索HBcrAg与cccDNA水平及转录活性的关系。
4 HBcrAg与未经治疗的慢性乙肝患者自然进程的关系依据2016年亚太肝病研究学会发布的乙肝指南，慢性乙肝的病程依照血清HBV DNA、HBeAg、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)水平等指标可分为4个自然史时期：免疫耐受期、免疫清除期、低复制期、再活动期。由于血清HBV DNA及ALT水平的波动及间歇异常，常常难以准确区分各个时期，从而易遗漏血清学指标无异常但仍发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌的患者，导致他们错过最佳的治疗时机[18]。因此，需要新的血清标志物来辅助判断未经治疗的慢性乙肝患者的病情进展，同时确定合适的治疗起点。
多项研究表明，HBeAg阳性慢性乙肝患者的HBcrAg水平高于HBeAg阴性患者[19-21]。Chan等[19]的研究提出，以HBcrAg水平为6 log U/mL来区分二者的敏感性可达97.3%，特异性为93.4%。在来自亚洲和欧洲的回顾性研究(涵盖了基因型A、B、C、D)中[19-21]，血清HBcrAg平均水平在未经治疗的免疫耐受期患者中为8.41~8.8 log U/mL，在免疫清除期患者中为7.92~8.5 log U/mL，在低复制期患者中为2.0~3.1 log U/mL，在再活动期患者中为4.5~4.92 log U/mL。同时，在未经治疗的患者中，HBcrAg与血清HBV DNA及HBsAg的相关性良好，或可作为其替代标志物。
在HBeAg阳性患者中，免疫耐受期患者的HBcrAg水平略高于免疫清除期患者[19-21]，提示低HBcrAg水平意味着更好的免疫控制状态。但尚未有合适的界值以区分二者。对于HBeAg阳性患者，HBeAg血清学转换常提示良好的长期预后，因此准确预测能自发进行血清学转换的患者，对指导抗病毒药物的使用，减少不必要的用药及经济负担有着重要的意义。在一项对免疫清除期患者随访1.5年的研究中[22]，在12周时，18例发生HBeAg血清学转换的患者的HBcrAg平均水平低于35例未发生血清学转换的患者(4.32 log U/mL vs 5.16 log U/mL，P < 0.05)，这一差距在28周时进一步扩大。而Chan等[19]的随访结果则显示，免疫清除期患者中发生HBeAg血清学转换组与未发生转换组的基线HBcrAg、HBV DNA、HBsAg水平等均无明显差异，仅在临近血清学转换前HBcrAg才会显著下降。二者结果的差异可能是因为后者的中位随访间隔时间在16个月以上，提示HBcrAg对于提前预测HBeAg血清学转换的时间有限，需要随访间隔时间更短的队列研究来进一步验证。
在HBeAg阴性患者中，再活动期患者的HBcrAg水平高于低复制期患者[19-21, 23-25]。目前，HBsAg阳性合并HBeAg阴性的患者是慢性乙肝最大的亚组，低复制期患者作为非活动携带者，往往提示更好的预后，因此，有效识别低复制期和再活动期，可为临床诊治及判断患者预后提供重要的依据。一项来自欧洲的多中心回顾性研究纳入了1 582例HBeAg阴性患者，发现以HBcrAg为3.14 log U/mL区分低复制期和再活动期的敏感性为91%，特异度为93%，优于HBsAg [24]。且HBsAg水平受不同基因型的影响较大，而HBcrAg则基本不受影响[23-24]。这些都提示HBcrAg可作为一个识别监测低复制期患者的更加稳定且可靠的指标。Maasoumy等[20]对47例未经治疗的低复制期患者进行随访发现，以HBV复发或达到治疗标准为临床终点时，HBcrAg水平低于3.87 log U/mL的患者该临床事件发生率较低，提示监测HBcrAg或可预测此类患者的复发风险，从而能针对复发的高危人群及时开展抗病毒治疗以改善预后。
综上所述，HBcrAg受基因型影响较小，在区分乙肝自然史时期中发挥着重要作用，但仍需要进一步研究以确定合适的区分界值。同时，持续密切监测HBcrAg能在一定程度上预测CHB患者的病情发展及预后，包括HBeAg血清学转换及HBV复发等，为临床开展抗病毒治疗提供指导，以改善患者预后。
5 HBcrAg与NA治疗或停药预后的相关性核苷(酸)类似物(NA)作为治疗慢性乙肝的主要药物，可显著抑制HBV的复制，但由于无法根除cccDNA或抑制其转录，因此达到功能性治愈的可能性较小，停药后也存在复发的风险。目前，仍缺乏有效的监测指标来判断NA长期治疗或停药的临床预后，因而难以预测远期疗效、确定合适的治疗终点。在NA经治血清HBV DNA低于检测下限的患者中，仍有相当部分患者体内可检测到HBcrAg[26-27]，提示其可作为NA治疗中监测病情、评估疗效及停药预后的重要指标。
NA的治疗效果可用HBeAg或HBsAg水平下降的幅度或血清学转换来评价。Van Campenhout等[28]对175例HBeAg阳性且接受恩替卡韦(Entecavir，ETV)单药治疗或联合IFN治疗的患者进行随访，以HBeAg转阴且HBV DNA低于200 IU/mL作为联合应答指标(combined response，CR)，发现无论是否联合IFN，发生CR的患者HBcrAg相较基线的下降水平均高于未发生CR者(ETV单药：-3.22 log U/mL vs -1.71 log U/mL，联合IFN：-3.16 log U/mL vs -1.83 log U/mL)，且发生CR前的每一时间点均如此，提示连续监测HBcrAg的动态变化可预测治疗结局。与此相似的是，另一项研究纳入了127例经NA或PEG-IFN或二者联合治疗的HBeAg阳性患者，发现相较于HBcrAg，基线pgRNA水平对HBeAg血清学转换的预测效果更好，而在动态变化方面，HBcrAg下降水平较于pgRNA则更具有预测价值[29]。在预测HBsAg水平变化方面，一项随访长达10余年的研究发现，以HBsAg水平低于100 IU/mL或血清学转换为理想的HBsAg应答(favourable HBsAg response, FHR)，在HBeAg阳性患者(N=28)中，早期HBV pgRNA下降水平对长期NA治疗后发生FHR的预测价值优于HBcrAg，而在HBeAg阴性患者(N=36)中，早期HBcrAg下降水平较于pgRNA对FHR的预测价值更高。治疗4周时，“HBcrAg水平下降≥2.05 logU/mL”对预测FHR的敏感度为75%[30]。这些研究说明：在不同时期的患者中，具有优势预测价值的指标不尽相同，相较于观测某一时间点的HBcrAg水平，动态监测HBcrAg的变化趋势更具有临床应用价值。
除了预测NA的疗效，也有多项研究表明，HBcrAg水平与停药后的临床转归密切相关。Sonneveld等[31]的多中心临床研究对572例HBeAg阴性的NA停药患者随访至少24周后发现，低HBcrAg水平的患者更易发生持续性病毒学应答(HBV DNA水平低于2 000 IU/mL)、HBsAg转阴或ALT水平正常等良好的临床结局。该团队后续在更大的NA停药队列中探究功能性治愈的预测因素，发现HBsAg与HBcrAg的水平对治疗终点具有一定的预测价值，HBsAg以10、100 IU/mL为界，HBcrAg以2 log U/mL为界，二者水平越高则功能性治愈的概率越低[32]。与此相印证，另一项研究对23例发生HBeAg血清学转换但HBsAg阳性的停药患者随访后发现，发生严重ALT反跳的复发患者在停药时的HBcrAg水平均高于检测下限，而轻度反跳或不反跳患者则均低于检测下限[27]。除了停药时的HBcrAg水平，也有研究发现基线HBcrAg水平或治疗过程中HBcrAg动态变化对预测疗效及停药后的临床转归有着重要作用。一项来自台湾的研究对301例HBeAg阴性且ETV停药≥12个月的CHB患者随访发现，治疗起始时的基线HBcrAg水平(而非停药时的HBcrAg水平)与停药后5年的复发率相关，基线HBcrAg水平高于4 log U/mL的患者复发率更高，且与停药时的HBsAg水平结合时其预测价值更高[33]。同一团队在对富马酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate, TDF)的停药研究中也发现，基线HBcrAg水平与停药时HBsAg水平相结合对复发的预测价值更大[34]。另外，HBcrAg与其他指标联合也可能对停药结局有更好的预测作用。Fan等[35]的多中心临床研究对127例NA停药病人随访4年发现，停药时的HBV RNA水平和HBcrAg水平是HBV复发的独立预测因素。HBV RNA阴性且HBcrAg水平低于4 log U/mL的病人复发概率低，HBsAg血清学转换概率高。Wang等[36]也发现，联合停药时的HBcrAg和pgRNA水平对预测复发(停药1年内HBV DNA水平高于2 000 IU/mL)的受试者工作曲线下面积(area under the receiver operating characteristic, AUROC)为0.857，优于单指标预测价值，且HBcrAg预测价值优于pgRNA。另一项来自台湾的研究则发现，NA治疗基线的准种多样性低且停药时HBcrAg水平≥2 000 IU/mL的患者停药后一年病毒复发率更高[37]。由此可见，NA停药时的HBcrAg水平对预测停药后的复发风险有着重要价值，低HBcrAg水平往往提示良好的临床结局。同时，结合HBsAg、HBV RNA、HBV准种多样性等指标可以获得更好的预测效果。
为方便临床应用，Hsu等[38]分析了135例NA停药患者的临床数据并提出了SCALE-B评分用以预测停药后的临床结局，具体参数包括HBsAg、HBcrAg、ALT与年龄，以260和320为界值分为低、中、高3个部分，得分越高者停药预后越差。近期Sonneveld等[31]的一项多中心研究对572例NA停药患者进行随访，并探究上述SCALE-B评分与预后的关联。发现得分越低，持续性病毒学应答率、HBsAg转阴率越高，ALT反跳率越低。这些研究提示，结合多项指标综合评判并建立相应的评分模型进行具体量化，或可对NA停药预后做出更加准确的判断，从而确定合适的治疗终点。
总体来说，治疗基线或停药时的低HBcrAg水平及治疗过程中HBcrAg水平的大幅下降往往意味着预后更好，如HBsAg转阴率高、ALT反跳率及复发率低等，与其他指标联合使用能提高预测价值，因此临床诊治的过程中可持续监测HBcrAg水平。未来也需要更大队列的研究进一步验证SCALE-B等评分模型的准确性或探索更适用的预测模型，为停药时机的选择及预后判断提供指导。
6 HBcrAg与干扰素治疗CHB患者临床预后的相关性聚乙二醇干扰素(peginterferon，PEG-IFN)是目前用于慢性乙肝治疗的重要药物，对诱导持续性病毒学应答、促进HBsAg转阴有着重要作用。HBcrAg水平对PEG-IFN疗效的预测作用仍存在争议，但大多数研究倾向于HBcrAg具有较好的预测作用，可为临床结局的判断提供指导。
Chuaypen等[39]的研究纳入了46例接受PEG-IFN治疗的HBeAg阳性患者，其病毒学应答(virological response，VR)的标准定义为治疗后24周HBeAg清除，HBV DNA < 2 000 IU/mL。结果发现，15例发生VR的患者HBcrAg及HBsAg的下降速度均快于未发生VR的患者，在治疗12周或24周时HBcrAg取8 log U/mL对72周发生VR的阴性预测值(negative predictive value，NPV)分别为94.4%(12周)和100%(24周)，与HBsAg持平或优于其对VR的预测表现。而在HBeAg阴性患者中，法国一项研究对接受PEG-IFN单药治疗(N=30)或联合TDF治疗(N=32)的患者停药后随访3年，发现HBsAg水平≥3.141 log IU/mL或HBcrAg水平≥3.45 log U/mL对持续应答(定义为HBV DNA低于检测下限或治疗后24周持续低于4 log IU/mL)的NPV分别为75.6%和71.8%，HBsAg水平≥3.141 log IU/mL或HBcrAg水平≥2.550 log U/mL对预测3年后HBsAg转阴的NPV分别为94.9%和86.3%，联合使用的预测价值并不高于单个指标[40]。
除了HBcrAg单一指标的预测作用，也有研究结果表明HBcrAg联合其他乙肝标志物或具有更高的预测价值。泰国一项研究发现，联合HBsAg与HBcrAg较于单个指标对疗效有更好的预测作用。该研究纳入121例HBeAg阴性患者，接受48周PEG-IFN单药治疗(N=62)或联合ETV治疗(N=59)，随访3年，以持续性HBV DNA水平 < 2 000 IU/mL或HBsAg转阴为病毒学应答的主要评价指标，发现高基线抗原水平(HBsAg水平≥3.4 log IU/mL联合HBcrAg水平≥3.7 log U/mL)或12周时HBsAg和HBcrAg水平均下降小于0.5 log U/mL者病毒学的应答率更低，联合应用的NPV高于HBcrAg和HBsAg各自单独应用时的NPV[41]。Huang等[42]的最新研究成果则发现，联合HBcrAg与HBsAb的预测作用更佳。该研究在257例NA治疗的患者中随机选择80例进行96周的PEG-IFN- α联合治疗，36例在治疗结束时达到功能学治愈，在IFN停药后的24周随访中，21例为持续性功能治愈，治疗结束时的HBcrAg水平低于4 log U/mL且乙肝表面抗体(HBsAb)水平高于2 log IU/L对此的阳性预测值(positive predictive value，PPV)为100%。
然而，也有研究发现HBcrAg对IFN疗效的预测作用并不明显。例如Lim等[43]在探究预测HBsAg转阴的血清标志物时则发现HBcrAg水平并无预测作用。该研究对114例HBeAg阴性且接受了48周PEG-IFN治疗(联合或不联合NA)的患者进行随访，其中15例发生了HBsAg血清学转换，治疗过程中HBsAg水平对此的预测价值最高，而HBcrAg和HBV RNA则对此贡献甚小。而Van Campenhout等[44]则发现，接受48周PEG-IFN治疗的患者在72周时发生应答(以ALT正常，HBV DNA水平低于2 000 IU/mL为标准)的患者比无应答者血清HBcrAg水平下降更多，但与HBV DNA及HBsAg相比并不能提供更好的预测效果。另外，Brakenhoff等[45]的研究纳入了230例HBeAg阳性患者和114例HBeAg阴性患者，接受PEG-IFN单药或联合NA治疗，发现停药后发生ALT反跳(≥5倍正常上限值)的患者持续病毒学应答或HBsAg转阴率较低，联合HBsAg及HBcrAg可预测ALT反跳的发生率，但预测效果不及HBsAg联合HBV RNA。
由此可见，在对IFN治疗的应答预测中，HBcrAg的作用在不同研究中不尽相同，可能的原因包括各研究的治疗方案、随访时间及评价指标不完全一致等。但总体而言，大部分研究支持HBcrAg水平可在一定程度上预测IFN的治疗结局的结论。HBcrAg水平低或下降幅度大往往意味着病毒学应答率、功能性治愈率高等更好的临床结局。不过，HBcrAg相较于HBsAg、HBV RNA的优越性以及单一指标与联合指标孰优孰劣，也有待更大样本量的研究来进一步验证。
7 HBcrAg与HBV相关的肝细胞肝癌发病率HBV感染是导致肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要原因。若能提前识别CHB群体中的HCC高危人群并及时开展抗病毒治疗，则有助于降低HCC的发病风险，改善临床预后[46-47]。如前所述，HBcrAg与肝内cccDNA水平及其转录活性正相关，反映了病毒的复制转录状态，提示其可能在预测HCC中亦发挥着重要作用。
在未经NA治疗的患者中，HBcrAg与HCC的关系首先由Tada等[48]报道。他们的研究纳入了1 031例未经NA治疗的慢性乙肝患者，中位随访时间10.7年，有78例发生了肝细胞肝癌。多因素回归发现，HBcrAg水平>2.9 logU/mL的患者HCC发病率高于 < 2.9 logU/mL的患者，风险比(hazard ratio，HR)为5.05。且不同随访年限的受试者工作曲线均提示，HBcrAg对HCC的预测价值比HBV DNA更高。香港的一项研究[49]纳入了207例HBeAg自发血清学转换的病人，平均随访13.1年，发现发生HBeAg血清学转换时，最终发展为HCC的患者的HBcrAg水平高于非HCC患者(5.68 log U/mL vs 4.78 log U/mL)，高HBcrAg为HCC的独立预测因素，HBcrAg水平高于5.21 log U/mL对HCC的阴性预测值可达97.7%。前2项研究的共同缺陷在于样本数不够多，台湾的一项研究克服了这一不足[50]，对2 666例未经治疗的HBsAg阳性患者平均随访15.95年发现，血清HBV DNA水平在2 000~19 999 IU/mL的病人，基线HBcrAg水平高于4 log U/mL意味着HCC的发病率更高(HR=4.89)，且预测效果优于HBsAg。此项研究进一步将患者限制在HBeAg阴性、ALT水平正常的范围内，这一结论依然成立(HR=6.29)。同一团队近期又对未经治疗的HBeAg阴性CHB患者进行随访分析，训练队列为2 150名台湾患者，验证队列为1 312名日本患者，结果表明在根据美国肝病研究学会乙肝指南未能定义分期的HBeAg阴性患者中(即不属于免疫活动期或非免疫活动期)，HBcrAg水平高于4 log U/mL者10年HCC累积发病率为5.33%，低于4 log U/mL者则为0.51%[51]。这表明在这类人群中HBcrAg可作为潜在的HCC预测指标，即以4 log U/mL为界值或可识别HCC高危患者，从而指导抗病毒治疗的合理开展。
在NA经治患者中，血清HBcrAg水平对HCC也有一定的预测作用。2016年Honda等[17]的研究纳入109例NA治疗至少2年的CHB患者，发现HBcrAg阳性(≥3 log U/mL)是预测HCC的独立危险因素(HR=3.53)。Hosaka等[52]的研究纳入了1 268例NA治疗长于1年的慢性乙肝患者，其中665例HBeAg阳性，601例HBeAg阴性，随访1年时HBcrAg水平高(界值分别为4.9 log U/mL、4.4 log U/mL)均提示HCC累积发病率更高。且持续高水平HBcrAg或治疗后HBcrAg水平升高组的HCC发病率高于持续低水平或治疗后HBcrAg水平降低组，提示连续监测HBcrAg或可有效识别HCC的高危人群。Liang等[53]则发现，在NA经治的1 042例HBeAg阴性患者中，基线HBcrAg水平高于2.9 log U/mL是预测HCC的独立危险因素，而在358例HBeAg阳性患者中，采用先前Hosaka等[52]的HBcrAg水平高于4.9 log U/mL标准却发现与HCC发病率无明显的相关性。上述研究说明尽管HBcrAg对HCC发病率有一定的预测作用，但目前仍缺乏一个公认可靠的界值。
Suzuki等[54]对449例慢性乙肝患者进行横断面研究，将HBsAg和HBcrAg分别以3 log IU/mL和3 log U/mL为界分为4个亚组，发现低水平HBsAg高水平HBcrAg组的HCC发病率最高。接着又对338例进行随访研究，得到了相似的结论，且受NA治疗状态的影响小。以上研究说明HBcrAg联合其他指标或可达到更好的预测作用。
除了预测HCC的发生，HBcrAg与HCC的预后亦有关联。Beudeker等[55]发现，在HCC早期[即巴塞罗那临床肝癌分期(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)0期或A期]的患者中，高水平的HBcrAg可能与更低的总体生存率和更高的复发率有关，而在包含所有分期的肝癌人群中这一关系不复存在，说明肝癌的分期不同可能会影响HBcrAg对预后的判断价值，提示后续可在进一步细化HCC分期的基础上探究HBcrAg与HCC预后的相关性。
因此，无论是否经过NA治疗，HBcrAg水平对慢性乙肝患者的HCC发生率均有一定的预测作用，高HBcrAg水平往往意味着HCC发病风险更高，但目前仍缺乏统一可靠的区分界值以供临床应用。同时，HBcrAg结合其他指标如HBsAg等进行共同预测或可提高准确率，从而有效识别HCC高危人群，及时调整对CHB患者的治疗方案，降低HCC发病风险。
8 结语综上所述，HBcrAg可反映慢性乙肝患者肝内cccDNA水平及转录活性。在未经治疗的患者中，持续监测HBcrAg水平可为抗病毒治疗的开展提供指导，而在NA或PEG-IFN经治的慢性乙肝患者中，HBcrAg水平与疗效及停药预后密切相关，低HBcrAg水平往往意味着更好的临床结局，联合其他指标或可为治疗终点的确定提供有力证据。同时，高水平HBcrAg常常提示HCC发病率提高，因此密切监测可有效识别HCC高危人群并及时干预。这些都体现出HBcrAg在临床应用中的巨大价值，并且与HBV DNA和HBsAg相比，HBcrAg受基因型的影响更小，具有更广泛的应用范围。除与临床结局的相关性外，近期也有研究发现HBcrAg可能与慢性乙肝患者的免疫状态有关：在HBeAg阴性患者中，低HBcrAg水平者CD4+T细胞应答更强[56]。因此，HBcrAg或可作为临床与基础的桥梁分子，从而通过基础研究解释临床现象。然而，目前的研究主要采用Lumipulse G1200 CLEIA analyser进行检测，其检测下限虽为2 log U/mL，但线性范围在3~7 log U/mL，而多项研究中HBcrAg检测结果及界值均小于3 log U/mL，这极大干扰了研究结果的准确性。因此，提高HBcrAg的检测灵敏度显得尤为重要。近期的iTACT检测方法降低了HBcrAg的定量下限，若其灵敏度与特异度能被更多研究所证实，则将会极大提高HBcrAg的检测精度，从而更好地应用于临床。
总的来说，HBcrAg作为新型的临床标记物，在监测慢性乙肝患者cccDNA水平及转录活性、确定治疗起点与终点、评估PEG-IFN或NA疗效与预后、预测HCC发病风险等方面发挥着重要作用，可为临床工作提供有力的指导与帮助。
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