弗尼斯弧菌属于革兰氏阴性杆菌，归属弧菌，天然存在于江、河、湖、海及含盐水域中，可引起鱼类或虾类疾病。人通过饮水或进食水产品而致病，引起为腹泻、胃肠炎、食物中毒以及创伤感染等^[1-2]。临床医生常根据患者的腹泻情况送检粪便进行微生物培养。本研究从1例急性腹泻患者大便标本中分离到弧菌。采用全自动细菌鉴定、药敏分析系统以及基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer，MALDI-TOF MS)技术等鉴定方法，均无法给出一致的鉴定结果。最终通过16S rRNA测序，得到基因组进行平均核酸一致性(average nucleotide identity，ANI)的比对，将此病原菌准确鉴定为弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)。现报道如下。

1 病历资料 1.1 基本情况

患者，男，53岁，自由职业者，2022年4月16日，因“多饮、消瘦18年余，视物模糊加重2月余”入院。流行病学史：无与新型冠状病毒肺炎确诊病例、疑似病例、无症状感染者等接触史。无与进口物品、进口冷链从业人员及口岸直接接触进口货物从业人员、隔离场所工作人员、国际交通运输工具从业人员等接触史。主诉4年来反复腹泻，7~8次/天，近几个月解泡沫便，较前明显增多，偶有上腹痛，饥饿时明显，进食后缓解。

入院后给予监测血糖，暂予胰岛素静脉泵强化降糖，予补液、改善肠道菌群等对症支持治疗。既往史：既往有诊断2型糖尿病并糖尿病视网膜病变3期、慢性胃窦炎、轻度食管胃底静脉曲张、颈椎病病史，具体不详。

入院诊断: ① 2型糖尿病、2型糖尿病性周围神经病变、2型糖尿病性视网膜病变；②腹痛查因。

1.2 实验室检查

随机血糖：26.2 mmol/L，酮体0.2 mmol/L，粪便常规组合：脂肪球+++, 华枝睾吸虫虫卵：+，隐血：阳性。血常规、肝功能等相关检查结果正常。

2 微生物学检查、鉴定及药敏试验 2.1 细菌培养

为进一步明确腹泻原因，送检患者粪便标本进行微生物病原学培养检查。患者粪便在35 ℃，体积分数5%的CO₂环境培养24 h后，SS平板正常肠道菌群生长(见图 1)，弧菌显色平板有绿色菌落生长(见图 2)，转种至血平板有圆形凸起，透明溶血环菌落生长(见图 3)。菌落革兰氏染色为阴性杆菌，该菌氧化酶阳性。

2.2 菌种鉴定 2.2.1 质谱检测结果

分别挑取弧菌显色平板以及纯分的血平板上单个菌落，加入裂解液及基质液后，进行质谱鉴定(安图Autof ms1000鉴定系统)，鉴定结果均为弗尼斯弧菌(分值9.502)。然而，梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统将其鉴定为河流弧菌(94%)，与质谱鉴定结果不一致。

2.2.2 测序结果

为了进一步证实鉴定结果的可靠性，将菌株送北京睿博兴科生物公司进行靶向DNA测序。16S rRNA测序基因扩增采用广谱引物：27f (5 ′ -AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3 ′)与1492r(5 ′ -GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3 ′)。用加热煮沸法提取细菌DNA，即用无菌接种环挑取2~3个单个菌落，置于1 mL无菌去离子水中，100 ℃加热20 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为基因扩增模板。16S rRNA基因扩增结果可见单一清晰目的条带，测序结果经blast比对，显示与弗尼斯弧菌(NR037067.1)序列的一致性为99.649%，与河流弧菌(NR114218.1)序列的一致性为99.508%，部分测序结果如图 4所示。

2.2.3 基因组平均核酸一致性计算与比较

从NCBI数据库下载弗尼斯弧菌全基因组序列。利用ANI Calculato (https://www.ezbiocloudnet/tools/ani)进行全基因组序列和参考模式菌株平均核酸一致性比对，结果如图 5所示。基于细菌全基因组信息的基因组ANI比较为物种的全面划分提供了新的途径，并且ANI值已成为现代细菌分类学中物种分界的金标准，95%~96%的ANI值被提出且被普遍接受为细菌物种分界线^[3-4]。此试验菌与参考模式菌株序列ANI值为99.8%，可判定实验菌株与此参考模式菌株为同1个种。

2.3 药敏试验结果

参考CLSI M45的要求进行药敏试验，VITEK 2 Compact AST334卡药敏结果显示，其对阿莫西林/棒酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星、复方新诺明均敏感。患者使用阿莫西林/棒酸治疗后，腹泻得到明显好转，解稀烂便次数明显减少。

3 讨论

本病例中，患者长期反复腹泻，7~8次/天。最终在患者粪便中培养出弗尼斯弧菌，同时粪便常规可查见华支睾吸虫虫卵。华支睾吸虫轻度感染者可无明显症状，重者则出现发热、腹泻、肝肿大、黄疸等症状。可采用吡喹酮与阿苯哒唑等药物进行驱虫治疗，从而改善腹泻症状。近年来，发现弧菌属中有能引起急性腹泻和食物中毒的肠道致病性弧菌，栖居于海洋水产品及小海鲜类动物肠道和体表，皆可在人类临床标本中分离得到^[5]。人类因摄入被污染的水、食物而感染，主要引起急性胃肠道炎症，典型症状是水样便、腹痛、轻到中度脱水、常伴有发热。针对本案例的病人，本研究未进行是否有食用水产动物及其制品或者接触海水产品的流行病学调查。弗尼斯弧菌所致腹泻的病例国内外报告均较少且时间久远，但从相关文献^[6-8]报道得知，弧菌感染与接触海水产品有很大的关系。因此，应加强公众卫生健康宣讲工作，积极开展针对性的健康宣教活动，养成良好的卫生习惯。

弗尼斯弧菌氧化酶试验结果为阳性，精氨酸双水解酶结果为阳性，发酵葡萄糖产酸产气。蔗糖、麦芽糖、甘露糖、阿拉伯糖、甲基红、枸橼酸盐、亚硝酸盐还原试验结果均为阳性。河流弧菌和弗尼斯弧菌皆为精氮酸阳性菌，曾被称为F群弧菌生物1型和2型，两者生化相似，主要区别为弗尼斯弧菌发酵糖类产气，两者VP反应结果皆为阴性^[5]。1981年，Lees等^[9]报告河弧菌是引起霍乱样腹泻的重要病原菌，并指出河弧菌可分为2个生物型，葡萄糖不产气为1型，常从腹泻病人、水、海产品中检出，即河流弧菌。葡萄糖产气为2型，即弗尼斯弧菌。1984年，Hickman-Brenner等^[10]报道，可通过分解葡萄糖产气与否的生化反应初步鉴别河流弧菌与弗尼斯弧菌。

2014年，Ramamurthy等^[11]在研究中表示，弗氏弧菌和河流弧菌为亲缘物种。16S rRNA基因、recA和toxR序列的核苷酸比较表明，弗尼斯弧菌和河流弧菌的相似性为100%。在gyrB序列中，霍乱弧菌、拟弧菌、弗尼斯弧菌和河流弧菌的相似度为93%^[10]。由此可知，16S rRNA基因难以区分弧菌属的近缘种。2014年Schirmeister等^[12]用了生化测试和MALDI-TOF MS 2种检测方法和3种基因型检测技术[rpoB测序、常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和实时PCR]，测定了32株河流弧菌和42株弗尼斯弧菌，发现通过生化反应的鉴定准确率最低，因为碳水化合物产生的气体表型差异很大。2018年Takajo等^[13]研究发现，使用常规引物的16S rRNA基因的PCR和使用Eco RV和Eae I的限制性片段长度多态性分析的组合，均可以区分河流弧菌和弗尼斯弧菌。以上两种方法无需昂贵的细菌鉴定设备或者特有引物组，是一个经济实用的检测方法。16S rRNA基因测序已经成为当前鉴定疑难少见菌的重要手段，但对于本案例的待测菌株而言，未得到一个准确的结果，因此16S rRNA是否能够通用于所有弧菌菌种的鉴定仍有待验证。

弗尼斯弧菌作为一种少见病原体，在较长时间内被认为是急性胃肠炎的病原菌。2017年Ballal等^[14]报道了印度第一例由弗尼斯弧菌引起的急性胃肠炎的病例报告。一名73岁的女性患者在食用海鲜后因急性肠胃炎入院，粪便中的病原菌经微生物学培养证实为弗尼斯弧菌，给予口服强力霉素和环丙沙星治疗后，患者好转出院。由于弗尼斯弧菌引起的食源性肠道疾病报道较少，其致病机制、生存适应性以及流行病学特征等尚待研究。

这是本地区第一次检出弗尼斯弧菌，当从病人粪便样本分离培养出少见病原菌时，检验人员应该给予重视。尤其是当这些细菌会引起人或动物感染发病，准确可靠的鉴定信息对于流行病学调查、应对传染病暴发和疾病防控至关重要。因弧菌属常规生化试验结果较相似，须通过MALDI-TOF MS技术进一步鉴定。但由于弧菌属在2~20 kDa的肽质量指纹谱相似度很高，特异性差，即使MALDI-TOF系统数据库中已包含弗尼斯弧菌的标准参考谱，仍会出现混淆误判的结果。尤其是弗尼斯弧菌与河流弧菌最为近缘，两种菌都会出现在鉴定结果中。张慧芳等^[6]通过分析MALDI-TOF对弧菌的识别能力发现，弗尼斯弧菌肽质量谱特异性差是造成识别错误的主要因素。对于此类少见弧菌的检出，可采用多种不同的鉴定方法，推荐通过ANI的比对，准确鉴定到种水平。本病例报道旨在为临床的诊治工作提供正确的方向。