2023, Vol. 18
2. 江苏大学消化疾病研究所，江苏 镇江 212000
2. Institute of Digestive Diseases, Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一，随着现代人生活方式的改变，其发病率逐年升高。2020年，在全球范围内结直肠癌新发病例数位列所有恶性肿瘤第3位，死亡病例数位列第2位，严重威胁人类健康[1-2]。目前，结直肠癌的治疗遵循以手术治疗为主，化学治疗和放射治疗为辅的原则，只能在早期治愈[3]。奥沙利铂、伊立替康和氟尿嘧啶类药物是治疗结直肠癌的一线化学药物，虽然疗效确切，但相当一部分患者因毒副作用而引发严重的不良反应[4]，给患者家庭带来了沉重的经济负担。因此，寻找更经济、有效的结直肠癌治疗方案迫在眉睫。
细菌外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)是革兰氏阴性菌产生的直径为10~300 nm的纳米级脂质双层膜性小泡[5]，最早于1965年由Bishop和Work[6]在观察赖氨酸限制条件下生长的大肠埃希菌时发现。1967年，Chatterjee和Das[7]通过电子显微镜观察到霍乱弧菌的OMV，含有许多细菌成分，包括蛋白质、脂质及多种病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，PAMP主要含肽聚糖、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、DNA和RNA等。基于OMV独特的结构特性，目前已被应用于疫苗、佐剂、药物载体及肿瘤治疗等方面[8]。
沙门菌(Salmonella)是最早用于肿瘤治疗的细菌之一，其中鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium，S. typhimurium)是研究最广泛的血清型，其分泌的OMV主要通过刺激免疫系统而发挥杀伤肿瘤的作用[9-11]。但沙门菌分泌的OMV是否对肿瘤组织具有直接抑制作用，目前鲜有报道。前期研究比较了鼠伤寒沙门菌OMV和伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S. Typhi)OMV对结直肠癌细胞增殖的影响，发现鼠伤寒沙门菌OMV对结直肠癌细胞的增殖无明显抑制作用，而伤寒沙门菌OMV有明显抑制作用。本研究拟探索不同培养条件下伤寒沙门菌OMV的差异及对结直肠癌细胞增殖的影响，明确伤寒沙门菌OMV是否对结直肠癌细胞增殖具有直接抑制作用，以期为结直肠癌治疗寻求新的方案提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与细胞伤寒沙门菌野生株GIFU10007由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠，结直肠癌细胞系HT-29、SW480和CT-26购自上海生命科学研究院细胞库。
1.1.2 主要试剂RIPM 1640细胞培养液、0.25%胰酶(Gibco公司)；胎牛血清(ExCell Bio公司)；DMEM高糖细胞培养液、细胞增殖-毒性检测试剂盒(Biosharp公司)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)。
1.1.3 主要仪器细胞超净台(苏州净化设备有限公司)；CO2培养箱、恒温摇床(美国Thermo公司)；超速离心机、流式细胞仪(美国Beckman公司)；NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪(英国Malvern公司)；HT7800透射电子显微镜(日本日立公司)；光吸收酶标仪(美国BioTek公司)；分光光度计、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(德国Eppendorf公司)。
1.2 方法 1.2.1 细菌培养挑取伤寒沙门菌野生株单克隆于新鲜LB液体培养基，置于摇床，37 ℃、250 r/min培养12~16 h作为种子液。次日，按1: 100的比例将种子液转接于新鲜LB液体培养基，继续培养至对数早期(OD600约为0.4)，向转接的LB培养液中分别加入浓盐酸使pH值为4.5、加入5 mol/L NaCl使渗透压为300 mmol/L、加入30% H2O2使其终浓度为5 mmol/L，以模拟伤寒沙门菌感染人体后可能遭遇的胃酸、高渗肠道液及细胞内氧化这3种应激环境。将剩余的种子液于25 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃上清液，用LPM培养基清洗后重悬，按1∶50的比例转接至LPM培养基，以模拟伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存环境，置于摇床，37 ℃、250 r/min继续培养至稳态期。
1.2.2 细胞培养结直肠癌细胞HT-29、SW480的培养使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，CT-26使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，当汇合度达到80%~90%时进行传代。
1.2.3 OMV的提取收集伤寒沙门菌野生株在不同培养条件下培养至稳态期的上清液，去除菌体，置于100 kDa超滤管中，4 000 g、4 ℃离心15 min进行浓缩，进一步使用超速离心机以150 000 g、4 ℃离心16 h，弃上清液，用适量无菌磷酸缓冲盐液(phosphate buffer saline，PBS)重悬管底沉淀，即可获得不同培养条件下的OMV，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，其余分装后置于-80 ℃保存。
1.2.4 OMV的粒径、形态将OMV原液用双蒸水稀释1 000~2 000倍，用注射器吸取稀释后的液体，经无菌滤器过滤后注入仪器的样品池内，设置好参数，分析OMV的粒径大小。吸取适量OMV原液滴于铜网上，静置数分钟后用滤纸从铜网边缘吸去多余液体，滴加磷钨酸染色液，负染2~3 min，烘干后进行透射电子显微镜观察。
1.2.5 OMV所含蛋白大小将OMV原液进行12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，按每孔10 μ g蛋白总量上样，用考马斯亮蓝染色。
1.2.6 CCK-8实验取对数生长期的结直肠癌细胞，按每孔1×103个细胞接种于96孔板，100 μ L/孔。实验分3组，每组设6个复孔。实验组：含细胞、RPMI 1640完全培养基及OMV；对照组：含细胞、RPMI 1640完全培养基，不含OMV；空白组：仅含RPMI 1640完全培养基。待细胞贴壁后，加入不同培养条件下的OMV(酸应激、高渗应激及氧应激培养条件下的OMV密度：1×109 particles/mL；LPM培养条件下的OMV密度：1×108 particles/mL)，继续培养24、48、72 h后，弃去孔内完全培养基，加入含10% CCK-8的无血清培养基，每孔100 μ L，避光孵育1~4 h。用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度值(OD450)，计算细胞活力。细胞活力=(处理组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100%。
1.2.7 克隆形成实验取对数生长期的结直肠癌细胞，按每孔500个细胞接种于6孔板，设OMV处理组及对照组，每组3个复孔，处理时间为1周，每隔2 d更换一次培养基，OMV密度保持不变。处理结束后，弃去培养基，用PBS洗2次，加入甲醇固定30 min，用1%结晶紫染色20 min，洗去过量结晶紫染液，晾干后进行拍照计数分析。
1.2.8 细胞周期检测取对数生长期的结直肠癌细胞，按每孔1.5×105个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁，加入一定密度的OMV处理48 h，胰酶消化收集细胞，用预冷的PBS漂洗2次，将细胞缓慢加入预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70%，于-20 ℃固定过夜。次日，离心弃去乙醇，根据细胞周期检测试剂盒说明书加入染料进行染色，37 ℃金属浴避光孵育30 min，立即用流式细胞仪检测。
1.2.9 小鼠体内毒性检测BALB/c小鼠适应环境1周后，随机分成两组(n=3)，分别为阴性对照组及OMV组(1×109 particles/mL)。OMV组经腹腔注射LPM培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV [以下简称OMV(LPM)]，阴性对照组以同样方式注射PBS，每天每只0.2 mL，共5 d。期间密切观测小鼠是否出现明显毒性迹象(食欲、体温、体重、有无腹泻等)，5 d后，所有小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出肝、肾组织，用4%多聚甲醛固定，进行脱水、石蜡切片、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、显微镜观察分析。
1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0、SPSS软件进行统计学分析，两组间均数比较采用t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同培养条件下OMV的形态及粒径分析为比较伤寒沙门菌在人体内应对不同环境所产OMV的差异，将伤寒沙门菌培养于正常、酸性、高渗、氧化环境LB液体培养基，以及LPM液体培养基，提取OMV后进行比较。透射电子显微镜下均可见圆形或椭圆形的脂质双层结构，纳米颗粒跟踪分析仪显示其直径大小均在30~400 nm，主要集中在100~300 nm，符合OMV的基本特征(见图 1A、1B)。伤寒沙门菌在正常、酸性、高渗、氧化环境LB液体培养基及LPM液体培养基中分泌的OMV平均数量分别为2.2×108、1.7×108、6.3×108、1.7×108、3.1×108 particles/107CFU。与其他培养条件相比，高渗应激环境下伤寒沙门菌能分泌更多的OMV(P＜0.05)(见图 1C)。
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| A and B: Morphology and size of OMVs under different culture conditions. Scale bar: 100 nm. a: LB medium; b: acid stress; c: hyperosmotic stress; d: oxidative stress; e: LPM medium. C: Yield of OMVs under different culture conditions. *P < 0.05. 图 1 不同培养条件下OMV的提取、鉴定及产量 Fig. 1 Extraction, identification and yield of OMV under different culture conditions |
为进一步分析不同培养条件下OMV所含蛋白相对分子质量的差异，用SDS-PAGE检测OMV所含蛋白大小。结果如图 2所示，在正常和酸性环境LB液体培养基中伤寒沙门菌OMV所含蛋白相对分子质量为37×103~72×103，在高渗和氧化环境LB液体培养基中OMV所含蛋白相对分子质量为25×103~72×103，而OMV(LPM)所含蛋白相对分子质量为8×103~55×103，表明OMV(LPM)含更多小分子蛋白。
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| 图 2 不同培养条件下OMV所含蛋白大小 Fig. 2 Protein distribution of OMV under different culture conditions |
CCK-8实验结果显示，OMV(LPM)对人结直肠癌细胞SW480及小鼠结直肠癌细胞CT-26的增殖均具有明显抑制作用，且随着作用时间的延长，抑制率逐渐上升，具有时间依赖性。其中OMV(LPM)处理SW480细胞48、72 h后，抑制率分别为21.6%、31.2%。其他培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV对HT-29及SW480细胞增殖均无抑制作用，但对CT-26细胞增殖有不同程度的抑制作用(见图 3A~3C)。克隆形成实验结果(见图 3D)显示，SW480和CT-26细胞经1×108 particles/mL的OMV(LPM)处理后，与对照组相比，克隆形成数量明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.001)，进一步确认了OMV(LPM)对结直肠癌细胞增殖的抑制作用。鉴于OMV(LPM)对SW480细胞的抑制效果明显大于CT-26细胞，故选用SW480细胞进行后续实验。
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| A, B and C: CCK-8 assay results of HT-29, SW480 and CT-26 cells affected by OMV under different conditions. D: Colony formation of SW480 and CT-26 cells affected by OMV in LPM medium. * * *P < 0.001, * * * *P < 0.000 1. 图 3 不同培养条件下OMV对结直肠癌细胞增殖的影响 Fig. 3 Effects of OMV on proliferation of colorectal cancer cells under different culture conditions |
流式细胞术检测结果(见图 4)显示，SW480细胞经1×108particles/mL的OMV(LPM)处理48 h后，与对照组相比，G0/G1期和S期比例显著降低，G2/M期比例显著提高(P＜0.01)，表明OMV(LPM)可将SW480细胞周期阻滞于G2/M期。
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| * *P < 0.01, * * * *P < 0.000 1. 图 4 LPM培养条件下OMV对结直肠癌细胞SW480细胞周期的影响 Fig. 4 Effect of OMV on cell cycle of SW480 cells in LPM medium |
如图 5所示，OMV(LPM)组与阴性对照组小鼠之间体重无明显差异。HE染色结果显示，两组肝、肾切片未发现明显病理改变，表明OMV(LPM)在小鼠体内没有产生组织毒性。
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| A: Body weight. B: HE staining of liver and kidney tissues. The magnification is 200×. 图 5 LPM培养条件下OMV对小鼠体重及肝、肾组织的影响 Fig. 5 Effects of OMV on body weight, liver and kidney tissues in mice in LPM medium |
有关细菌OMV的生物形成机制尚未完全清楚，目前主要有3种假说，分别为膜交联调控、膜压力聚集、膜脂质富集[12]。外膜蛋白A (outer membrane protein A，OmpA)、LppAB和Tol-Pal是革兰氏阴性菌维持细胞膜稳定性的3种主要交联成分，其减少会破坏细胞膜的稳定性，增加OMV的释放[13]。研究表明，鼠伤寒沙门菌突变株(Δ ompA、Δ lppAB、Δ pal、Δ tolB、Δ tolA)OMV的产量显著增加[14]。此外，温度、抗生素、培养基等因素也会影响OMV的产生[15]。到目前为止，伤寒沙门菌OMV在不同环境条件下表达的差异及具有的生物学功能还未有明确报道。
伤寒沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌之一，主要传播途径是粪口传播，可引起全身性感染。伤寒沙门菌经口进入人体消化道后，会依次面临胃液的酸应激、肠道的高渗应激及细胞内的氧化应激等不利因素，部分伤寒沙门菌经单核-巨噬细胞吞噬后可在细胞内生存和繁殖，最终导致全身性感染[16-17]。有研究表明，伤寒沙门菌遭遇上述不利因素时会调节自身基因的表达以适应环境的变化，但其分泌的OMV在形态学上的差异及具有的生物学功能尚未有明确报道。因此，本研究将伤寒沙门菌依次培养于酸性、高渗、氧化环境LB液体培养基及LPM液体培养基，以模拟其在感染人体过程中所遇到的不利因素(胃酸、高渗肠道液、细胞内氧化及巨噬细胞内环境)，收集其在不同培养条件下分泌的OMV，比较形态、粒径及所含蛋白大小。结果显示，不同培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV形态、大小无明显差异，在高渗应激环境下分泌的OMV更多。这可能是因为高渗应激下伤寒沙门菌的2个sigma因子RopE和RopS被激活，共同调控YgaE，而YgaE是gab操纵子的抑制因子，在高渗应激下YgaE会抑制OmpC、OmpF和OmpA的表达[18]，造成细胞膜稳定性下降，导致OMV释放增加。不同培养条件下伤寒沙门菌OMV所含蛋白相对分子质量不同，OMV(LPM)含更多小分子蛋白。
由于OMV独特的结构及免疫学特性，其抗肿瘤作用备受关注。Kim等[19]为探究OMV通过免疫疗法治疗癌症的潜力，将大肠埃希菌突变株(Δ msbB)OMV注射到皮下移植鼠结直肠癌细胞的小鼠中，发现可显著抑制肿瘤的生长且无明显不良反应。其抑制肿瘤的作用机制是OMV可特异性聚集于肿瘤组织，产生细胞因子CXCL10和干扰素γ，最终特异性杀伤肿瘤。但沙门菌分泌的OMV是否直接作用于肿瘤细胞，目前鲜有报道。本研究通过探讨不同培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV对结直肠癌细胞增殖的影响，以明确其是否对肿瘤细胞增殖具有直接抑制作用。CCK-8实验结果显示，OMV(LPM)能明显抑制结直肠癌细胞SW480及CT-26的增殖，且具有时间依赖性，克隆形成实验结果进一步证实了这一点。同时，流式细胞术检测结果显示，OMV(LPM)能将SW480的细胞周期阻滞于G2/M期，且小鼠体内毒性检测结果证实其未产生组织毒性。因此，本研究证实伤寒沙门菌OMV对结直肠癌细胞增殖具有直接抑制作用，但OMV(LPM)通过何种机制影响结直肠癌细胞增殖还须进一步研究。结合伤寒沙门菌OMV所含蛋白推测，OMV(LPM)可能通过某些小分子蛋白对肿瘤细胞的增殖发挥抑制作用。研究表明，细菌的某些组分或其分泌的物质对肿瘤具有杀伤作用，如细胞致死膨胀毒素(cytolethal distending toxin，CDT)，已证实多种革兰氏阴性菌(如伤寒沙门菌、大肠埃希菌等)可通过OMV分泌该毒素。CdtB作为CDT的活性部分，相对分子质量为28×103~32×103。CDT可干扰真核细胞周期进程，引起G2/M期阻滞和细胞凋亡，具有作为抗肿瘤药物的潜力[20]。此外，OMV(LPM)也可能通过其他成分如RNA、脂质等发挥抑制作用，为以后的机制研究提供了线索。
综上所述，本研究提取了不同培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV，并用其干预结直肠癌细胞，结果表明OMV(LPM)能直接作用于结直肠癌细胞，抑制细胞增殖并将细胞周期阻滞于G2/M期，有望成为治疗结直肠癌的新方案，但具体机制还须进一步研究。
| [1] |
Dekker E, Tanis PJ, Vleugels JLA, Kasi PM, Wallace MB. Colorectal cancer[J]. Lancet, 2019, 394(10207): 1467-1480.
[DOI]
|
| [2] |
Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-249.
[DOI]
|
| [3] |
张宇涛. 结直肠癌的治疗进展[J]. 山西医药杂志, 2020, 49(5): 535-536. [CNKI]
|
| [4] |
van Zoggel DMGI, Bosman SJ, Kusters M, Nieuwenhuijzen GAP, Cnossen JS, Creemers GJ, van Lijnschoten G, Rutten HJT. Preliminary results of a cohort study of induction chemotherapy-based treatment for locally recurrent rectal cancer[J]. Br J Surg, 2018, 105(4): 447-452.
[DOI]
|
| [5] |
Schwechheimer C, Kuehn MJ. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions[J]. Nat Rev Microbiol, 2015, 13(10): 605-619.
[DOI]
|
| [6] |
Bishop DG, Work E. An extracellular glycolipid produced by Escherichia coli grown under lysine-limiting conditions[J]. Biochem J, 1965, 96(2): 567-576.
[DOI]
|
| [7] |
Chatterjee SN, Das J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae[J]. J Gen Microbiol, 1967, 49(1): 1-11.
[DOI]
|
| [8] |
Sartorio MG, Pardue EJ, Feldman MF, Haurat MF. Bacterial outer membrane vesicles: from discovery to applications[J]. Annu Rev Microbiol, 2021, 75: 609-630.
[DOI]
|
| [9] |
Liang S, Wang C, Shao Y, Wang Y, Xing D, Geng Z. Recent advances in bacteria-mediated cancer therapy[J]. Front Bioeng Biotechnol, 2022, 10: 1026248.
[DOI]
|
| [10] |
Jazeela K, Chakraborty A, Karunasagar I, Deekshit VK. Nontyphoidal Salmonella: a potential anticancer agent[J]. J Appl Microbiol, 2020, 128(1): 2-14.
[DOI]
|
| [11] |
Chen Q, Huang G, Wu W, Wang J, Hu J, Mao J, Chu PK, Bai H, Tang G. A hybrid eukaryotic-prokaryotic nanoplatform with photothermal modality for enhanced antitumor vaccination[J]. Adv Mater, 2020, 32(16): e1908185.
[DOI]
|
| [12] |
Wang S, Guo J, Bai Y, Sun C, Wu Y, Liu Z, Liu X, Wang Y, Wang Z, Zhang Y, Hao H. Bacterial outer membrane vesicles as a candidate tumor vaccine platform[J]. Front Immunol, 2022, 13: 987419.
[DOI]
|
| [13] |
Nevermann J, Silva A, Otero C, Oyarzún DP, Barrera B, Gil F, Calderón IL, Fuentes JA. Identification of genes involved in biogenesis of outer membrane vesicles (OMVs) in Salmonella enterica Serovar Typhi[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 104.
[DOI]
|
| [14] |
Deatherage BL, Lara JC, Bergsbaken T, Rassoulian Barrett SL, Lara S, Cookson BT. Biogenesis of bacterial membrane vesicles[J]. Mol Microbiol, 2009, 72(6): 1395-1407.
[DOI]
|
| [15] |
Dell'Annunziata F, Folliero V, Giugliano R, De Filippis A, Santarcangelo C, Izzo V, Daglia M, Galdiero M, Arciola CR, Franci G. Gene transfer potential of outer membrane vesicles of Gram-negative bacteria[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(11): 5985.
[DOI]
|
| [16] |
MacFadden DR, Bogoch II, Andrews JR. Advances in diagnosis, treatment, and prevention of invasive Salmonella infections[J]. Curr Opin Infect Dis, 2016, 29(5): 453-458.
[DOI]
|
| [17] |
Mambu J, Virlogeux-Payant I, Holbert S, Grépinet O, Velge P, Wiedemann A. An updated view on the Rck invasin of Salmonella: still much to discover[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2017, 7: 500.
[DOI]
|
| [18] |
Wang M, Feng P, Chen X, Zhang H, Ni B, Xie X, Du H. YgaE regulates out membrane proteins in Salmonella enterica serovar Typhi under hyperosmotic stress[J]. ScientificWorldJournal, 2014, 2014: 374276.
[DOI]
|
| [19] |
Kim OY, Park HT, Dinh NTH, Choi SJ, Lee J, Kim JH, Lee SW, Gho YS. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon- γ -mediated antitumor response[J]. Nat Commun, 2017, 8(1): 626.
[DOI]
|
| [20] |
Kailoo S, Shreya, Kumar Y. Cytolethal distending toxin: from genotoxin to a potential biomarker and anti-tumor target[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2021, 37(9): 150.
[DOI]
|