2024, Vol. 19
表1(Table 1)
沙门菌广泛分布于自然界，寄生于人和动物体内，亦常见于被污染的蛋、肉类食品、饲料、水产品和污水等外环境。沙门菌是常见的人畜共患病的病原菌，可引起人类伤寒、副伤寒、胃肠炎、败血症和局部感染等多种疾病[1]。近年来，全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)技术快速发展，人们能够在基因水平上对致病菌进行鉴定并分析其分子生物学特征，筛选其毒力基因与耐药基因。同时基于WGS的病原菌分子分型方法的分辨力比传统分子分型方法更高，且具有很好的可重复性和实验室间可比性。
本研究对近年来从长春市食品安全风险监测和食源性疾病主动监测项目中获得的105株沙门菌进行全基因组测序和生物信息学分析。研究人员在前期工作中已对105株沙门菌的耐药基因进行了筛选，共筛选出10类69种耐药基因[2]。所有菌株均携带氨基糖苷类耐药基因，其中aac(6 ′)-Iaa基因携带率为100%；其次是aph(6)-Id和aph(3 ″)-Ib，携带率均为59.05%，并且二者同时存在；有4株肠炎沙门菌同时携带2个aph(6)-Id基因和2个aph(3 ″)-Ib基因。β -内酰胺类耐药基因携带率为73.33%，其中blaTEM-1B基因携带率为66.67%，blaOXA-1基因携带率为8.57%，其他基因为个别菌株携带。四环素耐药基因携带率为59.04%，其中tet(B)携带率最高，为39.05%；tet(A)携带率次之，为23.81%。磺胺类耐药基因携带率为72.38%，其中sul2基因携带率最高，为61.9%，其中1株里森沙门菌(JLF2140)携带4个sul2基因。氟喹诺酮类(20.95%)、氯霉素类(23.58%)、甲氧苄啶类(18.1%)和利福平类(11.42%)耐药基因分别以qnrS1(11.43%)、floR(20.0%)、dfrA1(13.33%)、ARR-3(8.57%)基因为主。大环内酯类耐药基因携带率较低(6.67%)，只有7株菌携带mph(A)基因，仅有1株菌(0.95%)携带林可酰胺类耐药基因lnu(F)。
本文筛选了105株沙门菌的毒力基因，并对其进行全基因组单核苷酸多态性分型(whole genome single nucleotide polymorphism，wgSNP)、多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)和全基因组多位点序列分型(complete genome multilocus sequence typing，cgMLST)，揭示菌株间的亲缘关系，为研究沙门菌的分子特征及疾病暴发的溯源提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 材料本研究所用菌株为2018年—2021年长春市食品安全风险监测和食源性疾病主动监测项目中分离鉴定得到的105株沙门菌，检测方法依据GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》[3]。21株已报道的流行株分别为：鼠伤寒沙门菌UK-1(英国)、U288(英国)、DT104(英国)、D23580(非洲)；伤寒沙门菌ERL034151(英国)、CMCST_CEPR_1(印度)、343077_213147(巴西)；里森沙门菌GJ0703-2(上海)；伦敦沙门菌HA1-SP5(江苏)、CVM N17S367(美国)；婴儿沙门菌SARB27(美国)、R21.1147(中国台湾)；肠炎沙门菌str607307-2(美国)、RM2968(美国)和EC20100134(加拿大)；沙门菌I 4, [5], 12: i: -08-1736(美国)、ST101(美国)、SO4698-09(英国)、PNCS014875(加拿大)、TW-Stm6(澳大利亚)。
1.2 方法 1.2.1 全基因组测序构建105株沙门菌的DNA样本文库(500bp)，利用Illumina测序平台进行双末端PE150测序，对原始数据进行de novo组装。
1.2.2 筛选毒力基因通过与毒力因子数据库(Virulence Factors Database, VFDB)进行序列比对分析，注释出105株沙门菌的毒力基因。
1.2.3 对样本进行多位点序列分型对105株沙门菌的7个管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA) 进行比对，得到每株沙门菌的7个基因位点的等位基因编号，进而获得每株菌的序列型(sequence typing，ST)。利用BioNumerics软件构建最小生成树。
1.2.4 对样本进行全基因组单核苷酸多态性分型利用MUMmer3.23软件将105株沙门菌和21株国内外已报道的沙门菌流行株的参考序列进行比对，寻找SNP，合并所有菌株的SNP结果，去除SNP距离小于5以及SNP区域未能比对上的，选择共有SNP获得SNP矩阵，得到96 158个SNP。利用FastTree对SNP序列构建wgSNP系统发育进化树。
1.2.5 对样本进行全基因组多位点序列分型从105株沙门菌的全基因组中筛选出核心基因组，分析后获得等位基因谱，进而获得每株菌的cgST。利用BioNumerics软件构建最小生成树。
2 结果 2.1 全基因组测序结果满足实验要求105株沙门菌全基因组测序的原始数据均满足数据量≥1 g clean data，数据质量Q30＞90%，测序平均深度为100×。
2.2 沙门菌毒力基因注释本研究共分析了144个沙门菌毒力基因，其中92个基因为105株沙门菌所共有，包括位于沙门菌毒力岛(Salmonella pathogenicity islands，SPIs)-1上的avrA\sicP\sicA\sipA\sipB\\sipC\\sipD\\invA\\invB\invC\invE\invF\ invG\invH\invI\invJ\avrA\orgA\orgB\ orgC\prgK\prgJ\prgI\prgH\sptP\spaS\spaR\spaQ\spaP\spaO\sopE2，位于SPI-2上的spiC\ssaB\ssa C\ssa D\ssa E\ssa G\ssa H\ssa I\ssa J\ssa K\ssa L\ssa M\ssa V\ssa N\ssa O\ssa P\ssa Q\ssa R\ssa S\ssa T\ssa U\sseA\sseB\sse C\sse D\sse E\sse F\sse G\sse L，位于SPI-3上的mgtC和位于SPI-5上的sopA\\sopB\\pipB，Ⅰ型菌毛基因fimI\\fimC\\fimD\\fimF\\fimH，卷曲菌毛蛋白形成相关基因csgA\\csgB\\csgC\\csgE\\csgF\\csgG，鞭毛蛋白基因fliG\\fliN。
105株沙门菌携带率在95.2%以上的毒力基因有sopD\misL\mig-14\pipB2\sseJ\shdA\iroB\sseK1\avrA\ratB\steB\lpfE，其中2株伤寒沙门菌(JLP1816、JLP1817)都不携带sseK1\iroB\avrA\steB\lpfE，4株里森沙门菌(JLF2137、JLF2140、JLP1909、JLP1834)都不携带ratB\\lpfE。一些毒力基因只有部分菌株携带，如全部40株肠炎沙门菌都不携带鞭毛蛋白基因fimM，gogB只被39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -和3株鼠伤寒沙门菌(JLP1814、JLP1836、JLP1837)携带，质粒编码菌毛基因pefB\pefC\pefD、毒性质粒基因spvB\spvC\spvR和rck只被39株肠炎沙门菌(除肠炎沙门菌JLP1810外)携带。还有的毒力基因只被个别菌株携带，如只在2株伤寒沙门菌(JLP1816、JLP1817)、约翰内斯堡沙门菌(JLF2141)、吉韦沙门菌(JLF2143)、奥雷宁堡沙门菌(JLP1806)、黄金海岸沙门菌(JLP2109)中检测到细胞致死膨胀素基因cdtB。只有2株伤寒沙门菌(JLP1816、JLP1817)携带cheD\\Vi抗原基因，4株伦敦沙门菌(JLP1804、JLP1906、JLP2008、JLF2142)和1株乙型副伤寒沙门菌(JLP1902)携带grvA，只在奥雷宁堡沙门菌(JLP1806)中检测到tcpC基因。
2.3 MLST结果提示沙门菌的ST型与血清型密切相关105株沙门菌共分为13种ST，如表 1所示。其中作为优势菌的40株肠炎沙门菌均为ST11型，39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -均为ST34型，3株鼠伤寒沙门菌为ST19型，另外3株鼠伤寒沙门菌为ST34型。对39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -与6株鼠伤寒沙门菌进行序列分析，发现6株鼠伤寒沙门菌(包括3株ST19和3株ST34)均具有hin-fljAB完整的II相鞭毛编码区。而39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -不具有fljA，flyB和hin基因，但其中37株保留了iroB基因。分别基于MLST和血清型构建105株沙门菌的最小生成树，发现沙门菌的ST与血清型密切相关(见图 1)。
| Serotype | Sequence type | Strains (n) |
| Salmonella typhi | 1 | 2 |
| Salmonella enteritidis | 11 | 40 |
| Salmonella typhimurium | 19 | 3 |
| Salmonella oranienburg | 23 | 1 |
| Salmonella thompson | 26 | 2 |
| Salmonella infantis | 32 | 3 |
| SalmonellaⅠ4, [5], 12: i: - | 34 | 39 |
| Salmonella typhimurium | 34 | 3 |
| Salmonella paratyphi B | 36 | 1 |
| Salmonella London | 155 | 4 |
| Salmonella goldcoast | 358 | 1 |
| Salmonella rissen | 469 | 4 |
| Salmonella johannesburg | 515 | 1 |
| Salmonella give | 516 | 1 |
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| A: Grouping by ST. B: Grouping by serotype. 图 1 分别基于多位点序列分型和血清型构建的105株沙门菌的最小生成树 Fig. 1 Minimum spanning tree based on MLST and serotype analyses of 105 strains of Salmonella |
本研究中的2株伤寒沙门菌为ST1型，参考菌株伤寒沙门菌ERL034151(英国)、CMCST_CEPR_1(印度)、343077_213147(巴西)为ST2型，研究对象与参考菌株之间略有差异。3株婴儿沙门菌与参考菌株婴儿沙门菌R21.1147(中国台湾)位于同一进化分支，而与婴儿沙门菌SARB27(美国)差异较大。1株约翰内斯堡沙门菌(ST515)和1株吉韦沙门菌(ST516)位于同一分支，提示二者亲缘关系密切。4株里森沙门菌与里森沙门菌GJ0703-2(中国上海)关系密切。4株伦敦沙门菌与伦敦沙门菌HA1-SP5(江苏)、CVM N17S367(美国)均位于同一分支内。40株肠炎沙门菌与参考菌株肠炎沙门菌str607307-2(美国)、RM2968(美国)和EC20100134(加拿大)大致位于同一分支。39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -和6株鼠伤寒沙门菌亲缘关系密切，与参考菌株鼠伤寒沙门菌UK-1(英国)、U288(英国)、DT104(英国)、D23580(非洲)、沙门菌I 4, [5], 12: i: -08-1736(美国)、ST101(美国)、SO4698-09(英国)、PNCS014875(加拿大)、TW-Stm6(澳大利亚)基本位于同一分支，受分离时间和来源影响较小。具体结果如图 2所示。
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| 图 2 基于全基因组单核苷酸多态性构建的系统发育进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree constructed by wgSNP |
105株沙门菌的cgST和ST完全相同。由构建的最小生成树可见，作为优势菌肠炎沙门菌和沙门菌I 4, [5], 12: i: -在不同时间(2018年—2021年)、不同来源(患者和食品)的标本中均有分布，且其血清型与cgST密切相关(详见图 3)。cgMLST较MLST更细致，更能说明菌株间的亲缘关系。如ST34型的3株鼠伤寒沙门菌来源于同一年份的不同患者，其中JLP1836和JLP1837关系较密切，而与JLP1814距离较远。
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| A: Grouping by cgSTs. B: Grouping by serotypes. C: Grouping by year. D: Grouping by samples sources. 图 3 使用cgMLST构建的105株沙门菌的最小生成树 Fig. 3 Minimum spanning tree based on cgMLST of 105 strains of Salmonella |
本研究通过WGS及生物信息分析技术，对105株沙门菌的毒力基因进行注释和筛选，发现长春市流行的沙门菌具有多种毒力基因(包括毒力岛、菌毛、黏附类因子、质粒上的毒力基因等)，为研究长春市沙门菌的致病性提供数据支持。
SPIs的基因相对稳定，沙门菌的大多数毒力基因由SPIs编码。学者们已在沙门菌中发现了17个SPIs，SPI-1和SPI-2编码2个不同的Ⅲ型分泌系统[4]，SPI-1存在于沙门菌的所有血清型中[5]，与侵入宿主细胞、诱导巨噬细胞凋亡有关。SPI-2 Ⅲ型分泌系统编码sseL，它能够阻止宿主体内的免疫细胞迁移，削弱宿主清除细菌的能力，使细菌在体内形成持续的慢性感染[6-10]。除分泌系统外，沙门菌还有许多毒力因子(如鞭毛、菌毛)参与黏附、侵袭、免疫逃逸、抗生素耐药、营养摄取等过程[11-13]。本研究提示，在细菌血清型不同的背景下，沙门菌中pefB\\pefC\\pefD(与菌毛形成有关)、spvB\\spvC\\spvR(与侵袭力有关)和rck(增强宿主免疫反应的抵抗力)、cdtB(细胞致死膨胀素基因)等基因的携带率相差较大。
研究结果提示，长春市沙门菌的主要流行株为肠炎沙门菌(ST11)和沙门菌I 4, [5], 12: i: -(ST34)，二者与国外流行株均有密切的亲缘关系。吴曼菊等[14]研究表明，肠炎沙门菌是我国部分地区沙门菌的优势血清型之一。这一结果与本研究一致。近年来，国内外沙门菌I 4, [5], 12: i: -的检出率均在不断上升[15-16]，该型已经成为导致人类沙门菌病最常见的血清型之一。沙门菌I 4, [5], 12: i: -在遗传上与鼠伤寒沙门菌关系密切，一直被认为是由后者进化而来[17]。沙门菌I 4, [5], 12: i: -是鼠伤寒沙门菌丢失II相鞭毛抗原表达能力的单相变体。前期的比较基因组学研究发现，两者的主要区别是鼠伤寒沙门菌拥有完整的II相鞭毛编码基因簇，而沙门菌I 4, [5], 12: i: -缺乏完整的II相鞭毛编码基因簇[18]，本研究再次证实了这一发现。蒋增海等[19]通过仔猪致病性试验和全基因组测序毒力基因分析，证实沙门菌I 4, [5], 12: i: -与鼠伤寒沙门菌具有相似的致病性。本研究发现，39株沙门菌I 4, [5], 12: i: -(ST34)与3株鼠伤寒沙门菌(ST34)均携带毒力基因gogB，另有3株鼠伤寒沙门菌(ST19)不携带gogB，而沙门菌I 4, [5], 12: i: -与鼠伤寒沙门菌携带的其他毒力基因的相似性接近100%。2018年—2021年的主动监测发现，长春市沙门菌I 4, [5], 12: i: -在数量上已经远超鼠伤寒沙门菌，并且均为ST34型。国内其他地区也有沙门菌I 4, [5], 12: i: -均为ST34的报道[19-20]，与本文一致。当前，沙门菌ST34型多重耐药现象严重，相关部门应高度重视，加大监测力度。
基于WGS的病原菌分子分型和溯源的方法，目前主要有wgSNP、wgMLST和cgMLST，这3种方法均具有分辨率高、重复性好的优点。但wgMLST和wgSNP对计算资源的消耗巨大，且wgSNP对测序的准确性要求极高，故推广难度大；相比之下，cgMLST对计算能力的需求不多，应用性更强[21]。目前，cgMLST已广泛用于沙门菌的分子分型中[22-23]，并将在细菌分型、疾病暴发后溯源等研究中展示更大的发展潜力和应用价值。
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