2024, Vol. 19
2. 复旦大学上海医学院，教育部、卫健委医学分子病毒学重点实验室，上海 200032;
3. 堪培拉大学，澳大利亚首都直辖区 2617
2. Key Laboratory of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical, Sciences, Shanghai Medical College of Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. University of Canberra, Australia Capital Territory 2617, Australia
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染仍然是严重威胁人类健康的公共卫生问题，全球约有2.92亿人患有慢性HBV感染，占全球人口的3.9%，我国慢性HBV感染者的数量更是高达约7 000万，其中2 000万~3 000万人患有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)[1-2]，CHB不仅是肝纤维化和肝硬化的主要病因，还极大地增加了患者发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的风险[3-4]。目前，临床上用于治疗慢性HBV感染的常规药物主要为2种干扰素(标准和聚乙二醇化的干扰素)和5种核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、特比夫定、恩替卡韦和替诺福韦)[5]，但这些治疗手段往往难以达到功能性治愈，且无法完全消除进展为严重肝病的风险[6-8]。此外，长期使用抗病毒药物可能导致病毒耐药性的出现，另外患者须终生服药，这增加了患者的经济负担和心理压力，因此，开发新的治疗药物和策略显得尤为迫切。
HBV感染的疾病进展复杂，不仅与病毒本身的特性有关，还受到宿主遗传背景及环境因素的影响[9-10]。环境因素如酒精消费和黄曲霉毒素暴露也显著影响慢性乙型肝炎的进展，增加了肝脏疾病恶化的风险。除了感染个体的感染途径、年龄、性别、免疫状态和潜在疾病(如肥胖、糖尿病和肾功能衰竭)等宿主因素外[11-12]，有大量证据证明宿主的遗传背景差异是影响HBV感染后临床转归的重要因素。双胞胎研究和全基因组相关性研究揭示了人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、细胞因子基因、Toll样受体(Toll like receptor，TLR)等的多态性与HBV感染易感性和免疫反应紧密相关[13-17]，特别是HLA Ⅱ类分子的HLA-DP、HLA-DQ与HBV清除能力显著相关，这也突显了遗传背景在HBV感染免疫应答中的重要作用。
HBV感染的最终结果受到适应性免疫系统，尤其是产生HBV特异性抗体的B细胞和HBV特异性T细胞反应的控制[18]。急性和慢性HBV感染患者的免疫响应差异，指示了疾病转归的免疫学基础，尽管现有研究通过不同遗传背景小鼠模型探讨了宿主对HBV免疫反应的差异，但这些模型通常倾向于模拟急性清除状态，难以准确反映慢性HBV感染的免疫耐受期的特征[19]。因此，分析宿主遗传背景对HBV感染的影响，有助于更好地阐明HBV转归的免疫学机制，对于开发出新一代的免疫治疗方法和抗病毒策略，最终实现乙肝治愈具有重要的现实意义。
故本研究使用了先前建立的慢乙肝AAV8-rcccDNA小鼠模型[20]，用AAV8-rcccDNA重组病毒感染Alb-Cre转基因C57BL/6小鼠并产生HBV rcccDNA，以实现长期的抗原血症和中低水平病毒复制，模拟人类HBV免疫耐受期的特征。本研究通过将C57BL/6 Alb-Cre小鼠与2种不同品系小鼠(FVB/N、DBA/2)进行杂交，观察F1代小鼠(FVB/N×C57BL/6、DBA/2×C57BL/6)感染AAV8-rcccDNA重组病毒后的免疫学反应差异，旨在揭示遗传背景对HBV感染免疫应答的影响。这种方法不仅模拟了慢性HBV感染的免疫环境，而且为深入理解HBV感染的不同模型之间免疫耐受和免疫清除的差异性反应的免疫学机制提供了有力工具，为开发针对HBV的新型治疗策略提供思路。
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雌性8周龄FVB/N、DBA/2小鼠购自上海市计划生育科学研究所实验动物部。雄性8周龄Alb-Cre转基因C57BL/6小鼠[B6.Cg-Tg(Alb-Cre)21Mgn/J]引自美国Jackson实验室(stock number：JAX-003574)，由上海市公共卫生临床中心实验动物部提供。
1.1.2 细胞和质粒HEK293T细胞购买自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，AAV8载体包装质粒pRC8和pHelper由吉林大学于湘辉教授惠赠[21]，pAAV8-rcccDNA载体是将带有loxP位点的prcccDNA序列融合到AAV8载体创建而成的。
1.1.3 实验试剂DMEM培养基、胎牛血清FBS购自德国BI公司；L-谷氨酰胺、胰酶-EDTA、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司；氯仿、无水乙醇、异丙醇购自上海国药化学试剂；HBV表面抗原、e抗原ELISA检测试剂盒购自上海科华生物；羊抗鼠IgG-HRP购自美国Santa Cruz公司；鼠源HBsAg、HBcAg购自杭州华葵金配生物科技有限公司；鼠源HBsAb购自武汉市赛尔维科技技术有限公司；乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒[聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)-荧光探针法]购自长沙圣湘生物科技股份有限公司；兔抗鼠IgG-HRP、羊抗HBs-IgG购自洛阳畅元生物科技有限公司。
1.1.4 仪器超速离心机购自美国Beckman公司；蠕动泵购自英国LongerPump公司；荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪、低温(4 ℃)离心机、微孔板恒温混匀器、细胞培养箱购自美国Thermo公司；台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。
1.2 实验方法 1.2.1 AAV8-rcccDNA病毒包装HEK 293T细胞铺15 cm细胞培养皿，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中保存24 h至细胞密度达到70%~80%，使用三质粒系统(pAAV8-rcccDNA、pRC8和pHelper)和PEI 40000K进行AAV8-rcccDNA病毒转染。转染后24 h和48 h更换10 mL新鲜培养基继续培养，转染后72 h收集含有AAV8-rcccDNA细胞用于病毒纯化。
1.2.2 AAV8-rcccDNA病毒纯化采用氯化铯(CsCl)超滤法进行AAV8-rcccDNA病毒纯化。将含有病毒的细胞反复冻融3次并超声破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液至50 mL离心管中。向离心管中加入Benzonase核酸酶消化去除转染残留的质粒DNA后，添加固体CsCl将密度调整至1.41 g/mL，70 000 r/min，4 ℃，离心过夜以形成病毒溶液密度梯度。收集不同密度组分，通过定量PCR (quantitative PCR, qPCR)检测，收集富集病毒颗粒的组分并使用100k Da的透析袋在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中进行透析。收集透析后的AAV8-rcccDNA病毒，使用qPCR测量滴度后分装冻存于-80 ℃。
1.2.3 Alb-Cre转基因近交系小鼠感染模型构建FVB/N、DBA/2小鼠(雌性，8周龄)与C57BL/6的Alb-Cre转基因小鼠(雄性，8周龄)进行杂交，通过尾静脉注射法将1×1011 vg(viral genome copy number)的AAV8-rcccDNA病毒导入杂交产生的携带Alb-Cre转基因的F1代小鼠(雄性，7~8周龄)肝脏中，从每只新生F1代小鼠尾部剪取约0.5 cm长的尾巴样本，提取DNA并进行PCR检测，用于确认小鼠是否携带Cre基因，Alb-Cre转基因小鼠在感染AAV8-rcccDNA后，如前所述[20] Cre重组酶能有效识别并剪切携带loxP位点的HBV rcccDNA，从而模拟HBV的持续感染和复制状态。确定建模成功后在1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18和20周通过眼眶下眦静脉丛采血并分离血浆，实验结束后采集小鼠肝脏，使用质量分数4%的多聚甲醛固定液用于苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE staining)。模型小鼠建模、饲养及后续实验均在上海市公共卫生临床中心实验动物中心生物安全2级实验室进行。所有动物研究均按照实验动物饲养管理和使用指南(国家卫生健康委员会)[22]进行，并经上海市公共卫生临床中心动物伦理委员会批准。
1.2.4 HBV抗原、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和HBV DNA检测乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B s antigen，HBsAg)、ALT的定量检测委托兰卫医学检验所(中国上海)通过罗氏Cobas 8000全自动生化免疫分析仪进行。血浆HBV DNA含量采用乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光探针法)进行测定。
1.2.5 HBsAb及HBcAb检测将HBsAg或HBcAg加入Elisa板过夜包被后，使用PBS-Tween 20 (体积分数0.05%) 洗涤3次，用体积分数2%的BSA封闭1 h后，加入稀释后的小鼠血浆、阴性对照和阳性对照，孵育1 h，洗涤3次，加入山羊抗鼠IgG-HRP，孵育1 h后，使用3, 3 ′, 5, 5 ′ -四甲基联苯胺(3, 3 ′, 5, 5 ′ -tetramethylbenzidine，TMB)作为底物显色，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，用OD450代表HBsAb或HBcAb的相对含量。
1.2.6 HBsAg-HBsAb免疫复合物检测将山羊多克隆抗体HBs-IgG加入Elisa板过夜包被后，使用PBS-Tween 20 (0.05%) 洗涤3次，用2% BSA封闭1 h后，加入稀释后的小鼠血浆、阴性对照和阳性对照，孵育1 h，洗涤3次，加入兔抗鼠IgG-HRP，孵育1 h后，使用TMB作为底物显色，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，用OD450代表HBsAg-HBsAb免疫复合物的相对含量。
1.3 统计学分析本研究中统计学分析均采用Graphpad Prism 7.0统计软件进行，数据中曲线下面积值(area under the curve，AUC)是通过每个检测指标中单只小鼠所有时间点的数据计算得出。对于服从正态分布的定量连续数据，使用非配对T检验方法对不同组别之间的变量进行差异分析，对于不符合正态分布的数据则采用非参数检验方法中的曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验。采用Pearson相关分析比较HBsAg与HBsAb的相关性，所有统计结果均以P＜0.05代表差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 两种遗传背景的小鼠对AAV8-rcccDNA免疫反应的比较HBsAg、HBsAb的血清学转换与病毒消退以及免疫控制密切相关，因此本文首先对2种品系(DBA/2×C57BL/6与FVB/N×C57BL/6)小鼠模型血浆中HBsAg、HBsAb进行了检测，以研究不同品系小鼠对体内HBV复制表达的免疫反应。结果显示，2种品系小鼠在初始阶段的HBsAg水平均为2 000 IU/mL，从第8周起，DBA/2×C57BL/6小鼠的HBsAg显著降低至10~100 IU/mL，而FVB/N×C57BL/6小鼠持续维持高水平的HBsAg(1 000 IU/mL) (见图 1A)。1~20周HBsAg累积表达量检测结果显示，FVB/N×C57BL/6的水平显著高于DBA/2×C57BL/6(P=0.026)(见图 1B)。关于HBsAb，FVB/N×C57BL/6小鼠在实验初期(第3~4周)HBsAb水平较低，而DBA/2×C57BL/6小鼠的HBsAb水平则持续较高(见图 1C)，将HBsAb的表达量累积分析，DBA/2×C57BL/6小鼠显著优于FVB/N×C57BL/6小鼠(P=0.045 5)(见图 1D)。两种品系小鼠的HBsAg与HBsAb动态监测结果揭示，建模后2~4周HBsAg水平下降后反弹，而HBsAb水平在此期间达峰后减少，暗示两者可能存在负相关，这些结果提示了不同遗传背景小鼠在HBV感染免疫应答上存在差异。
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FVB/N×C57BL/6 (n=5) and DBA/2×C57BL/6 (n=6) mice were administered 1×1011 vg of AAV8-rcccDNA virus via tail vein injection. Serum levels of HBsAg and HBsAb were measured at 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 weeks post-injection. A: HBsAg quantification was performed using the Roche Cobas e601 automatic electrochemiluminescence immunoassay system at the specified time points. B, D: The area under the curve (AUC) for HBsAg, HBsAb levels over time was calculated for each mouse using GraphPad Prism version 7.0, incorporating data from all assessed time points. C: HBsAb titers were determined through ELISA following a 20-fold dilution in PBS at the time intervals. 图 1 DBA/2×C57BL/6与FVB/N×C57BL/6小鼠对AAV8-rcccDNA免疫反应比较 Fig. 1 Comparison of immune responses to AAV8-rcccDNA in DBA/2×C57BL/6 and FVB/N×C57BL/6 mice |
为了进一步确认HBsAg与HBsAb之间的关系，本文对HBsAg与HBsAb阳性率以及相关性进行了分析，结果发现FVB/N×C57BL/6品系中，观察到一只小鼠在第3周和第4周由HBsAg单阳性状态转变为HBsAg和HBsAb双阳性，之后随着抗体水平的下降，再次回到HBsAg单阳性状态(见图 2A)。而在DBA/2×C57BL/6品系中，所有小鼠在第1周均表现为HBsAg单阳性，第2周开始随着部分小鼠开始产生抗体，转为HBsAg和HBsAb双阳性状态，到了第3周随着部分小鼠的体液免疫反应增强，逐步过渡到HBsAb单阳性，至实验结束，HBsAb单阳性率达到50%(见图 2B)。这一发现与传统观念中HBsAb的出现导致HBsAg消失的理解有所不同，在本研究的模型系统中，HBsAb的出现并不总是导致HBsAg的持续消失，反而可能出现反复。将所有时间点的全部数据进行相关性分析，发现HBsAg与HBsAb的表达水平呈现出动态负相关，即“此消彼长”的趋势(见图 2C)。这表明，要维持对HBsAg的有效体液免疫压制，可能需要高滴度抗体的长期存在。
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FVB/N×C57BL/6 (n=5) and DBA/2×C57BL/6 (n=6) mice were administered 1×1011 vg of AAV8-rcccDNA virus via tail vein injection. Serum levels of HBsAg and HBsAb were quantified at intervals of 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20 weeks post-injection. A: The threshold for HBsAg positivity was established at >1 IU/mL. B: HBsAb levels were determined by the OD450, adjusted by subtracting a cut-off value obtained from the mean of negative controls + 2SD, following a 20-fold plasma dilution. HBsAb positivity was defined as values greater than 0. The positivity rate was calculated as the proportion of HBsAb positive mice relative to the total. C: Pearson correlation analysis was applied to assess relationships across all time points for each biomarker in both mouse strains. 图 2 小鼠血浆中HBsAg和HBsAb阳性率与相关性分析 Fig. 2 HBsAg and HBsAb positive rate and correlation analysis in sera of different mice groups |
鉴于FVB/N×C57BL/6小鼠和DBA/2×C57BL/6小鼠均出现HBsAg与HBsAb共存的状态，因此本文进一步检测了小鼠血浆中HBsAg-HBsAb免疫复合物的状态。检测结果显示，在2种品系小鼠中，HBsAg-HBsAb免疫复合物表现出3种不同的状态：①HBsAg持续保持阳性，无论HBsAb早期产生后消失还是从未产生过，HBsAg-HBsAb免疫复合物持续阳性(见图 3A，D, E)；②HBsAb长期高滴度存在，随着HBsAg的消失，HBsAg-HBsAb免疫复合物耗尽后转为阴性(见图 3C)；③HBsAb早期呈低水平的波动性，未出现HBsAg转阴，免疫复合物在早期波动后转阴(见图 3B)。根据HBV感染过程中免疫反应动态(见图 3A~E)，可以将其变化规律归纳为HBsAg主导期、HBsAg-HBsAb免疫复合物主导期和HBsAb主导期3个阶段(见图 4)，这3个阶段反映了免疫反应在感染过程中的不同主导因素，且不同品系小鼠之间的免疫反应强度波动导致这些阶段可能会出现不同的先后顺序和反复转换，这与体液免疫反应的基本原理相契合。
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FVB/N×C57BL/6(n=5) and DBA/2×C57BL/6 (n=6) mice were inoculated with 1×1011 vg of AAV8-rcccDNA virus via tail vein injection, with assessments conducted at multiple time points post-injection (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 weeks). A-E: Serum HBsAg levels were quantified using the Roche Cobas e601 automatic electrochemiluminescence immunoassay. HBsAb titers were determined via ELISA following a 20-fold dilution in PBS. The HBsAb data were calculated as the OD450 minus a cut-off value of 0.4499, after 20-fold plasma dilution. The HBsAg-HBsAb immune complexes were also quantified using ELISA after a 20-fold dilution, with OD450 readings adjusted by a cut-off value of 0.482. 图 3 小鼠血浆中HBsAg、HBsAb和HBsAg-HBsAb免疫复合物(immune complex，IC)表达情况 Fig. 3 HBsAg、HBsAb and HBsAg-HBsAb IC in sera of different mice groups |
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| 图 4 HBV感染过程中免疫反应动态变化 Fig. 4 Schematic diagram of dynamic changes in immune responses during HBV infection |
本文还对2个不同品系小鼠(FVB/N×C57BL/6和DBA/2×C57BL/6)血浆中HBV DNA、HBeAg和HBcAb的水平进行了分析，以评估HBV感染的病毒载量和宿主的免疫响应。起始时，2种品系小鼠的HBV DNA水平大致相当，约为104 IU/mL，且在整个实验期间未观察到显著变化，这指示病毒在体内维持稳定的复制水平(见图 5A)。HBeAg的表达模式在2种品系小鼠中呈现差异。实验前4周，两者的HBeAg含量均缓慢上升，之后DBA/2×C57BL/6小鼠的HBeAg水平开始下降，而FVB/N×C57BL/6小鼠则持续上升，最终FVB/N×C57BL/6的HBeAg含量显著超过DBA/2×C57BL/6(见图 5B)，与两者血浆中HBsAg表达情况基本一致。而HBcAb在实验全程保持较低水平(见图 5C)。
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FVB/N×C57BL/6 (n=5) and DBA/2×C57BL/6 (n=6) were used to introduce 1×1011 vg AAV8-rcccDNA virus into mice by tail vein injection. All data were determined at different time points (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 weeks) after injection. A: HBV DNA levels were determined by qPCR. B: Serum HBeAg levels were measured by Roche Cobas e601 automatic electrochemiluminescence immunoassay. C: The result of plasma dilution 200 times after measuring OD450 minus cut-off value. The cut-off value is 0.0855 (cut-off value is the mean value of negative samples +2SD). 图 5 小鼠血浆中HBV DNA、HBeAg和HBcAb表达水平 Fig. 5 HBV DNA、HBeAg and HBcAb levels in sera of different mice groups |
为了评估AAV8-rcccDNA模型对2种品系小鼠(FVB/N×C57BL/6和DBA/2×C57BL/6)肝脏功能的影响，本文检测了血浆中谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)水平，结果表明，在整个实验周期内，2组小鼠的ALT水平均未出现明显上升，保持在正常范围内(＜120 U/L)，提示HBV的表达和复制未导致显著的肝脏损伤(见图 6A)。进一步通过HE staining对小鼠肝脏切片进行组织学评估，结果显示与对照组相比，建模小鼠肝组织中偶尔可见少量淋巴细胞浸润，但未观察到严重的淋巴细胞浸润或炎症性病灶(见图 6B)，这进一步支持了ALT测量结果，表明在AAV8-rcccDNA感染模型中，小鼠的肝脏炎症反应较轻微，未引发明显的肝功能损害。
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A: ALT results were tested using Roche COBAS 8000 system. B: After modeling, the mice were killed at 2, 4, 7, and 10 weeks, and the liver was separated. After soaking in formaldehyde, the liver was embedded in paraffin and then stained by HE (40×objective). 图 6 DBA/2×C57BL/6与FVB/N×C57BL/6小鼠肝脏损伤与组织病理学分析 Fig. 6 Liver damage and histopathological analysis in DBA/2×C57BL/6 and FVB/N×C57BL/6 mice |
既往研究表明，HBV感染过程中病毒复制与宿主免疫反应之间的相互作用决定了感染的最终转归[23]，其中，宿主的适应性免疫反应，尤其是CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞的功能，对HBV的清除起着至关重要的作用[24-25]。然而，现有研究主要集中在研究单一近交系小鼠对于HBV感染免疫响应或者是针对特定免疫细胞的作用，对于宿主遗传背景如何综合影响HBV感染后的免疫应答和病毒清除机制的理解仍然有限。因而，本研究针对不同遗传背景小鼠(FVB/N×C57BL/6和DBA/2×C57BL/6)对AAV8-rcccDNA模型的免疫响应进行了深入探讨。
本研究发现，2种品系小鼠在AAV8-rcccDNA模型中展现出显著的免疫响应差异。FVB/N×C57BL/6小鼠呈现出持续的HBsAg表达和较低的HBsAb水平，表现出一种免疫耐受状态，而DBA/2× C57BL/6小鼠感染模型展现出了与临床HBV急性感染后恢复相似的免疫反应模式，包括HBsAg的消失、HBsAb的阳性反应以及病毒复制水平的中到低程度。可能是由于FVB/N的小鼠存在NKT细胞缺陷[26]，小鼠体内无法正常产生可清除HBV的自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)[27-28]。因而，FVB/N小鼠模型更倾向于出现免疫耐受。
但是本文结果与既往研究结论却不同，Chou等[19]利用高压尾静脉注射法研究FVB/N(H-2q)和DBA/2(H-2d)小鼠对HBV的免疫应答，结果显示，FVB/N小鼠在第4周HBsAg阳性率为0，而DBA/2在第8周的阳性率为75%。可能是由于高压尾静脉注射导入病毒的方式会导致肝细胞损伤，从而导致炎症因子的表达[29]，而本文的小鼠模型肝功能检测中均未见到肝损伤。不仅如此，在HBcAb诱生方面，FVB/N×C57BL/6与DBA/2×C57BL/6血浆中仅检测到较低水平的HBcAb，但在以往实验中通过使用重组HBcAg和完全弗氏佐剂免疫不同近交系小鼠能够诱发出强烈的HBcAb反应[30]。有研究指出，不同近交系小鼠的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)单倍型H-2连锁基因对HBV特异性体液和细胞免疫反应不同[31-32]，然而本文使用的小鼠模型为杂交产生的F1代，由于MHC遗传具有多态性、共显性的特点，故无法通过亲本的H-2分型分析出F1代小鼠的H-2连锁基因[33]。目前关于HBV感染的小鼠模型主要集中于近交系小鼠的对比研究，因此目前尚不清楚导致本研究与既往研究结果差异的具体原因，未来研究仍须进一步探讨2种杂交系小鼠遗传背景差异及针对HBV的CD4+和CD8+ T细胞反应，以深入理解HBV感染的免疫机制。
综上所述，本研究通过深入探讨不同遗传背景小鼠品系(FVB/N×C57BL/6与DBA/2×C57BL/6)在AAV8-rcccDNA模型中的免疫反应，突显了宿主遗传背景在HBV感染治疗与研究中的重要作用，并为理解宿主遗传因素对HBV感染免疫应答、病毒清除及其临床转归的影响提供了新的视角。同时，本项工作对现有HBV感染动物模型进行了改进，通过为近交系小鼠杂交提供更多模型选择，从而为HBV感染机制的进一步研究及未来乙肝治疗药物和疫苗开发提供了新的方向，但仍须在更广泛的遗传背景和模型系统中进一步验证这些发现，以期为乙型肝炎的个性化治疗及预防策略的制定贡献更全面的科学依据。
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