2. 上海市东方医院南院检验科,上海 200120
2. Department of Laboratory Medicine, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200120, China
弯曲杆菌属是一种呈弯曲状、“S”形或螺旋状的杆菌,菌体直径为0.2~0.9 μ m,长度为0.5~5.0 μ m[1],是引发人类细菌性胃肠炎的常见原因之一,其中最常见的是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) [2-3]。上海市疾病预防控制中心针对2013—2016年上海市门诊腹泻患者弯曲杆菌感染的监控数据显示:腹泻患者弯曲杆菌感染的平均阳性率为1.7%,且以空肠弯曲杆菌感染为主[4]。空肠弯曲杆菌感染后除引发肠炎外,还可引起菌血症、肝炎、胰腺炎、流产、新生儿败血症和脑膜炎、化脓性关节炎等肠外感染[5-6]。研究表明菌血症的发生在肠道感染者中占0.15%,其中老年人发病率最高[7]。目前,氟喹诺酮类、大环内酯类和四环素是临床治疗弯曲杆菌感染的首选药物[8]。鉴于血流感染空肠弯曲杆菌较为少见,本研究报道1例从老年女性患者血液中分离到的空肠弯曲杆菌,并对其可能存在的耐药基因进行检测分析,旨在为临床诊疗相关疾病提供科学的实验室依据。
1 病例资料患者女性,82岁,无明显诱因出现晕厥1次,发热1天,最高体温38 ℃,伴大小便失禁,无视物旋转,无畏寒寒战、咳嗽咳痰、胸闷气急、恶心呕吐、腹痛腹胀腹泻、咽痛头痛头晕、乏力、全身酸痛、抽搐等情况。既往高血压病史30余年,平素口服拜新同控制血压,既往糖尿病病史20余年,予胰岛素控制血糖。否认冠心病及脑梗死病史。生活习惯规律,无疫水、毒物、放射线等有害物质接触史。
查体情况如下。血压:158/89 mmHg,神志清楚,精神可,呼吸尚平,浅表淋巴结未及肿大,口唇无绀,口角无歪斜,伸舌居中。颈软,颈静脉无怒张。两肺呼吸音清,未闻及少量湿性啰音。心率86次/min,律齐,各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹软,无压痛,无反跳痛,无肌卫,肝脾肋下未及,移动性浊音阴性。双下肢肌力IV级,肌张力正常。双下肢无浮肿。辅助检查:快速C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)52.41 mg/L ↑,白细胞10.05×109/L↑,红细胞4.47×1012/L,血小板计数182×109/L,血红蛋白130 g/L,中性粒细胞计数9.03×109/L↑,粪便常规:红细胞0个/HP (high power len),白细胞0个/HP,隐血试验(胶体金法) 阳性,入院后完善相关检查,中段尿培养阴性,肿瘤标志物检测、动态心电图、头颅磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、胸部计算机断层扫描术(computer tomography, CT)检查显示未见明显异常。期间使用益保世灵、头孢西丁抗感染,同时口服拜新同控制血压,症状无明显好转。2天后血培养结果提示空肠弯曲杆菌阳性,根据药敏试验结果加用阿奇霉素治疗,治疗方案为:阿奇霉素一次500 mg,一日1次,持续使用3天。经治疗3天后患者症状好转出院。
2 材料和方法 2.1 仪器与试剂Versa TREK 6240全自动血培养仪、需氧树脂瓶、血平板、麦康凯琼脂培养基、克氏双糖铁培养基、巧克力平板购自北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)仪购自重庆中元生物有限公司;脱纤维羊血购自上海源叶生物工程公司;MH琼脂、左氧氟沙星、环丙沙星、红霉素和四环素购自英国OXOID公司;革兰氏染色液购自美国贝索公司。
2.2 方法外周血经需氧培养瓶培养2天后报阳性结果,取瓶内血液转种至血平板、麦康凯琼脂培养基、克氏双糖铁培养基和不含万古霉素的巧克力平板,置于35 ℃、体积分数5% CO2的环境中培养。按常规细菌鉴定方法进行革兰氏染色、氧化酶和触酶试验。采用Biotyper MALDI-TOF MS仪、测序仪进行菌种鉴定。体外药物敏感性试验参照美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的纸片扩散法进行,各种抗菌药物浓度、具体操作方法和判断标准均参考CLSI M45文件[9]。对分离菌株进行3种耐药基因(gyrA、gyrB、tex(O)) 检测,引物序列、扩增条件参考文献[10-12],产物用0.5×TBE配制的含质量分数1%Goldview染液的琼脂糖凝胶电泳,以100 bp DNA Ladder Marker为参照,于凝胶成像系统中观察结果。
3 结果分析 3.1 革兰氏染色将阳性血培养瓶中的血液转种于血平板、巧克力平板后置于35 ℃,体积分数5%的CO2培养箱中培养,于第2天观察血平板上出现的细小、针尖样菌落,直接进行革兰氏染色,镜下观察可见革兰氏阴性弯曲状杆菌菌体形态有逗点样、海鸥展翅样和螺旋样弯曲等多种类型(见图 1)。
3.2 培养特性培养第2天可见细小、针尖样菌落,3~5天后在血平板上可形成圆形突起、湿润、不溶血、边缘整齐、灰白色半透明的菌落(见图 2)。
3.3 菌种鉴定及药敏试验经MALDI-TOF MS仪和测序仪准确快速鉴定为空肠弯曲杆菌。体外药敏试验结果显示,该菌株对环丙沙星及四环素耐药,对红霉素敏感。
PCR结果显示:与喹诺酮类抗生素耐药密切相关的耐药基因gyrA、gyrB在本例菌株中均有表达,同时与四环素耐药有关耐药基因tet(O)也有表达,这与药敏试验结果一致。
4 讨论大多数弯曲杆菌感染表现为急性、自限性肠炎,可能会发生反应性关节炎和神经疾患等并发症,少数患者会出现格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS),导致呼吸肌麻痹而死亡[13]。空肠弯曲杆菌是弯曲杆菌感染中最常见的一种,除了可引起急性肠炎,还可引起肠外感染,如菌血症、尿路感染等,对于免疫功能低下者可能会引发持续性腹泻和菌血症[14],但在免疫功能正常的患者中通常具有自限性。一般从感染到出现症状的潜伏期为72 h,感染通常在1周内消退[15]。而空肠弯曲杆菌感染罕见血流感染为迁延性,并伴反复发热,且感染来源不明确,主要侵犯免疫力低下的患者。本病例中患者为82岁老年女性,并患有糖尿病、高血压等基础性疾病,本文推测可能由于其机体抵抗力差,免疫功能低下,从而导致空肠弯曲杆菌趁机而入引起菌血症。此类患者常常因为起病隐匿、症状不典型且医院检验水平有限而被误诊或延误治疗[16]。本病例中老年患者因晕厥、大小便失禁等神经疾患入院,未见其他症状,表现极不典型。临床诊疗中根据患者的症状体征、辅助检查结果等以排除颅内感染、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤等疾病。实验室检查结果提示存在细菌感染,但具体细菌类型和入侵途径尚不明确,只能经验性治疗。本研究通过血培养明确了具体的细菌类型,并根据药敏试验结果针对性地予以抗感染治疗,患者好转后出院。
近年来,随着广谱抗菌药物、激素类药物、免疫抑制剂的广泛使用,以及机械通气、介入性诊疗等创伤性诊疗技术的大量应用,血流感染(bloodstream infection,BSI)的发生率有逐年升高的趋势,其病原微生物谱也在变迁[17-18]。BSI的病原谱因地区、年龄、基础疾病等的不同其分布情况亦有差异。近30年来,全球BSI的病原菌逐渐由革兰氏阴性杆菌为主转为革兰氏阳性球菌为主,如凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等,此外,随着抗感染药物、各种人工装置、静脉导管等的使用频率增加,耐药菌也在不断增加[19]。血流感染的发病率在全世界范围内处于较高水平[20-21],美国一项长达6年的回顾性队列研究显示,住院患者菌血症的发生率为5.9%,致死率为15.6%[22]。英国败血症每年造成约10万人住院,并导致3.7万人死亡[23]。一项来自墨西哥的研究显示,儿童中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的BSI死亡率分别为19.2%和45.2%[24]。
血培养作为当前判断患者是否感染致病菌最可靠的手段,在降低各种由病原微生物所致的死亡率方面有着不可忽略的价值[18]。血培养不仅可以明确血流感染的致病菌种类,还可以获得其药敏试验结果,从而为临床诊疗提供更科学有效的参考依据,更重要的是,可以避免各种药物滥用所致的多重耐药菌的出现。目前,氟喹诺酮类、大环内酯类和四环素类是临床上治疗空肠弯曲杆菌的首选药物。本病例中体外药敏试验结果提示空肠弯曲杆菌对喹诺酮类、四环素耐药,未发现其对大环内酯类耐药。临床诊疗时根据体外药敏试验结果选用阿奇霉素抗感染,效果较好。耐药基因检测发现gyrA、gyrB有表达,推测空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药的主要机制可能是位于拓扑异构酶的喹诺酮类抗生素的耐药决定区(quinolone resistance-determining region, QRDR)氨基酸残基改变。这个区域内发生突变是弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素产生耐药的主要机制[25-26],与本次药敏试验结果相符。同时,药敏试验结果提示空肠弯曲杆菌对四环素耐药,推测可能与tet(O)基因的存在密切相关[27-29]。本病例中通过及时对病原体进行药敏试验并对可能存在的耐药基因进行检测,为临床精准治疗提供了更科学有效的参考依据。
本报道通过对外周血进行培养,利用质谱仪和测序仪快速准确地鉴定病原体为空肠弯曲杆菌,为临床明确病因提供了重要依据。明确病原体后及时进行体外药敏试验,从而指导临床合理使用抗生素,并对其可能存在的耐药基因进行合理分析,为临床有效治疗相关疾病提供了科学的实验室依据。
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