2018, Vol. 13
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是一种介于细菌与病毒、能独立生长繁殖的最小原核细胞型微生物，可引起上呼吸道感染、支气管炎、肺炎等疾病，其中肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)占儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的10%~40%[1]。近年来，MPP导致的免疫损伤机制备受关注。机体感染肺炎支原体后免疫力低下，易合并细菌或病毒感染，其中Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是常见病原体之一。临床发现，MPP合并EBV感染较单纯MPP引起的肺内及肺外损伤更严重，多数观点认为主要与细胞免疫机制有关[2-3]。本研究拟通过检测MPP合并EBV感染患儿血清中白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-4、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、IL-10的水平变化，了解患儿机体免疫状态，探讨这些指标在MPP合并EBV感染诊断中的临床应用价值。
1 材料与方法 1.1 研究对象选取2016年9月—2017年3月上海市第六人民医院儿科住院部收治的MPP合并EBV感染患儿作为观察组(A组)，单纯MPP患儿作为单纯感染对照组(B组)，小儿骨科择期行六指切除手术患儿(近期无感染)作为健康对照组(C组)。A组61例，B组103例，C组23例。根据2013年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的儿童重症肺炎诊断标准[4]，将A组患儿分为重症肺炎组和普通肺炎组，其中重症肺炎组15例，普通肺炎组46例。
1.2 纳入及排除标准MPP诊断标准[5]：①符合第8版《诸福棠实用儿科学》支原体肺炎临床特点；②单份血清肺炎支原体特异性IgM抗体效价≥1:160，或短期(1周)内双份血清肺炎支原体IgM抗体效价上升4倍及以上，或短期(1周)内双份血清肺炎支原体IgM抗体效价阴性转阳性。
EBV感染诊断标准[6-7]：①EBV衣壳抗原(viral capsid antigen，VCA)IgM(+)或早期抗原(early antigen，EA)IgG(+)，且抗EBV核抗原(EBV nuclear antigen，EBNA)IgG (-)。
重症肺炎诊断标准[4]：符合2013年中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的儿童重度社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)诊断标准，存在以下任何一项：①一般情况差；②拒食或脱水征；③有意识障碍；④呼吸频率明显增快(婴儿＞70次/min，年长儿＞50次/min)；⑤发绀；⑥呼吸困难(呻吟、鼻翼翕动、三凹征)；⑦多肺叶或≥2/3的肺受累；⑧胸腔积液；⑨脉搏血氧饱和度≤0.92；⑩肺外并发症。
排除标准：①病程中出现呼吸道以外的感染症状，包括皮肤、泌尿系统感染等；②长期使用糖皮质激素或近3个月内使用免疫球蛋白等免疫抑制剂和免疫调节剂。
1.3 实验方法所有患儿均于入院第2天采集静脉血。采用被动凝集法检测肺炎支原体特异性IgM抗体，试剂盒购自富士瑞必欧株式会社。采用德国欧蒙公司酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测EBV特异性抗体，按说明书操作。留取静脉血2.0 mL，自然凝固10~20 min，3 000 r/min离心20 min，取血清，-80 ℃保存。用酶标仪测光密度(optical density，OD)。
本研究获得所有患儿监护人的知情同意，并经上海市第六人民医院医学伦理委员会批准。
1.4 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。所有数据以x±s表示，并进行正态性及方差齐性检验，3组之间比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一般资料A组患儿中，男33例，女28例，平均年龄(5.24±1.38)岁；其中婴幼儿期11例(18.03%)，学龄前期31例(50.82%)，学龄期19例(31.14%)。B组患儿中，男65例，女38例，平均年龄(4.01±3.25)岁；其中婴幼儿期22例(21.36%)，学龄前期36例(34.95%)，学龄期45例(43.69%)。C组患儿中，男15例，女8例，平均年龄(6.31±0.65)岁；其中婴幼儿期2例(8.70%)，学龄前期5例(21.74%)，学龄期16例(69.57%)。3组患儿的年龄分布及性别差异均无统计学意义(图 1~2)。
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| 图 1 MPP合并EBV感染患儿的年龄分布 Fig. 1 Distribution of age in children with MPP combined with EBV infection |
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| 图 2 单纯MPP患儿的年龄分布 Fig. 2 Distribution of age in children with MPP |
3组患儿血清IL-6、IL-4、IFN-γ、IL-10水平差异显著。其中A和B组IL-6、IL-4、IFN-γ、IL-10水平高于C组(P＜0.05)，A组IL-6、IL-10水平高于B组(P＜0.05)，而A与B组IFN-γ、IL-4水平差异无统计学意义(表 1)。
| Group | n | IL-6 | IL-4 | IFN-γ | IL-10 |
| A | 61 | 68.00±9.17*# | 13.80±1.06* | 40.71±1.88* | 25.50±1.71*# |
| B | 103 | 35.00±7.46* | 10.91±2.84* | 40.50±10.42* | 15.52±6.03* |
| C | 23 | 12.51±0.46 | 7.93±2.65 | 14.71±1.88 | 5.52±1.03 |
| F value | 5.734 | 1.548 | 0.768 | 7.352 | |
| P value | 0.034 | 1.87 | 0.923 | 0.001 | |
| *P＜0.05 compared with group C, #P＜0.05 compared with group B. | |||||
A组重症组患儿血清IL-6、IL-10、IL-4水平高于非重症组(P＜0.05)，而IFN-γ水平无统计学差异(表 2)。
| Group | n | IL-6 | IL-4 | IFN-γ | IL-10 |
| Severe | 15 | 67.00±2.17* | 28.83±2.46* | 35.71±3.52 | 24.47±2.86* |
| Non-severe | 46 | 49.67±8.46 | 14.91±6.34 | 35.82±11.43 | 13.56±10.49 |
| F value | 11.331 | 5.769 | 14.238 | 5.492 | |
| P value | 0.000 | 0.049 | 1.096 | 0.000 | |
| *P＜0.05. | |||||
MPP最常见的临床表现有发热、咳嗽及喘息。由于肺炎支原体与心、脑、肺、肝及平滑肌等多种人体组织器官存在部分相同抗原，其感染后除引起肺部炎症外，还累及血液、皮肤、消化、心血管、中枢神经等引起多系统损伤。MPP的临床症状轻重程度不一，严重者可危及生命。关于MPP的发病机制，国内外学者主要倾向以下两种。①黏附损伤：肺炎支原体借助黏附素吸附于宿主细胞后，产生过氧化氢、超氧化基团和神经毒素等，引起呼吸道上皮细胞的氧化应激反应，并分泌社区获得性呼吸窘迫综合征(community-acquired respiratory distress syndrome，CARDS)毒素等，对呼吸道上皮造成损伤。②免疫损伤：包括自身免疫损伤和免疫抑制损伤。自身免疫损伤即肺炎支原体感染后产生的抗肺、脑及其他组织的自身抗体与抗原结合形成抗原-抗体免疫复合物，补体和免疫细胞在自身抗体和免疫复合物的诱导下被激活，从而削弱机体免疫屏障。免疫抑制损伤即肺炎支原体侵入宿主后破坏正常T细胞与B细胞比例，造成淋巴细胞多克隆活化，破坏CD4+/CD8+动态平衡，使Th1/Th2失衡，引起机体免疫抑制。EBV是一种嗜B细胞疱疹病毒，在儿科病毒感染性疾病中非常普遍。病毒携带者和病毒感染者是传染源，主要通过亲吻等经口密切接触的行为传播，因此被称为“接吻病毒”。由于传染源广泛、传播途径简单，EBV初发感染多发生于儿童时期，90%以上学龄前儿童曾感染过EBV[8]。EBV首先侵犯上皮细胞和B细胞，通过gp350/200与B细胞表面的CR2结合而进入B细胞，并诱导其分化为记忆性B细胞，形成长期潜伏感染，在宿主免疫力低下或环境改变时EBV大量激活，引起疾病[9]。EBV感染可使多器官、多系统受累，首发症状不一。6岁以下儿童原发性EBV感染大多表现为无症状感染或上呼吸道感染等非特异性表现；但在青少年期，约50%的原发性EBV感染可表现为传染性单核细胞增多症[10-11]。
近年来国内大量研究发现，MPP合并EBV感染患儿较单纯MPP患儿的肺内外炎症更严重，疾病更多样化。这可能与肺炎支原体和EBV的免疫机制相似有关，均表现为T细胞亚群紊乱，即CD4+/CD8+比例失调[12]。肺炎支原体感染可引起CD4+ T细胞凋亡，导致细胞免疫功能下降，进而激活长期潜伏于体内的EBV侵入B细胞，致使B细胞变性、凋亡，同时引起T细胞的强烈反应，CD8+T细胞大量增殖，免疫反应叠加，导致组织损伤加重[13-14]。IL-6、IL-4、IFN-γ、IL-10是重要的免疫细胞因子，在细胞免疫评价方面有重要作用。
Th细胞按功能分为Thl及Th2亚群。Th1通过分泌IL-2、IFN-γ、IL-12等促炎细胞因子介导细胞免疫应答，增强杀伤炎症细胞的细胞毒性作用；Th2通过分泌IL-4、IL-10、IL-5等抗炎细胞因子促进B细胞产生抗体，主要参与体液免疫调节。正常情况下，Th1/Th2比值处于动态平衡，一旦病理因素涉入，两者比值失衡，即导致机体出现相应的病理损伤。
刘文彬等[15]认为，肺炎衣原体感染可抑制Th细胞产生IL-2，从而使细胞免疫功能低下，易合并病毒感染或使原有病毒激活。低剂量IL-2可阻止EBV介导的淋巴组织增生性疾病[16]。有研究发现[17]，IL-2通过IL-6发挥免疫效应，而IL-6间接抑制细胞免疫功能。IL-6主要由活化的T细胞和B细胞、单核-巨噬细胞、内皮细胞等生成，可诱导B细胞分化并产生免疫球蛋白，促进T细胞增殖生长，具有免疫调节、促炎和抗感染等生物学作用[18-19]。当机体处于炎症和感染状态时，IL-6可促进CD4+ T细胞在Th2分化期间的IL-4产生，配合转化生长因子p(transforming growth factor p，TGF-p)抑制Thl分化，阻止活化的CD4+ T细胞凋亡[20]。肺炎支原体可通过细胞酪氨酸磷酸化信号转导和核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)激活，诱导单核细胞产生IL-6，继而引发促炎因子级联反应，增强中性粒细胞趋化及脱颗粒黏附作用，加剧炎症反应[21-22]。本研究发现，MPP合并EBV感染和单纯MPP患儿血清IL-6水平高于健康对照患儿，且MPP合并EBV感染所致重症肺炎患儿IL-6水平高于非重症肺炎患儿，表明IL-6可反映免疫损伤程度，与Tian等[23]的研究结论一致。
IL-4是Th0分化为Th2的关键细胞因子；IFN-γ可促进Th0向Th1分化，并减少IL-4 mRNA表达，从而抑制Th2分化过程[24]。MPP患儿肺泡灌洗液中，高菌量组IL-4水平及IL-4/IFN-γ比值显著高于低菌量组，提示肺炎支原体导致的Th1/Th2免疫偏移以Th2免疫反应占优势[25-26]。这种改变有利于机体清除病原体，削弱肺炎支原体感染引起的炎症反应。有文献报道，肺炎支原体感染机体后，IFN-γ水平明显升高，表明Th1/Th2免疫失衡以Th1占优势[27]。本研究发现，MPP合并EBV感染患儿的IL-4、IFN-γ水平较健康对照组升高，提示MPP合并EBV感染患儿存在Th1/Th2免疫平衡失调。随着病情加重，IL-4升高更显著，且Th2细胞免疫起主导作用。MPP合并EBV感染患儿的IL-4、IFN-γ水平与单纯MPP组相比无明显差异，可能与感染不同时期有关。Li等[28]发现，MPP急性期Th1占优势，恢复期转变为以Th2为主，表明MPP合并EBV感染后细胞免疫可由Th1向Th2转变。
IL-10具有强抗炎和负向免疫调控作用，可直接拮抗IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎性因子的释放以减轻机体炎症反应。出现炎症瀑布反应时，IL-10主要通过抑制抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，间接降低T细胞活性和免疫应答能力来抑制免疫功能，从而大大增加机体再次感染的概率[29-30]。研究证实，诱导性调节性T细胞(induced regulatory T cell，iTreg)主要通过分泌IL-10来发挥负向免疫调节作用[31]，而Th17/Treg免疫平衡与MPP的发生发展密切相关[32-34]。本研究提示，MPP合并EBV感染及单纯MPP患儿血清IL-10水平显著升高，混合感染所致重症肺炎患儿血清IL-10较普通肺炎更高，原因可能是免疫抑制增加了感染概率而使病情加重。
综上所述，Th1/Th2细胞免疫功能紊乱在MPP合并EBV感染的发生发展中起重要作用。肺炎支原体、EBV可通过诱导机体分泌IL-6、IL-4、IFN-γ、IL-10造成组织损伤，这些指标对评估MPP合并EBV感染患儿的细胞免疫紊乱程度有重要意义。
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