2019, Vol. 14
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)是一种革兰染色阴性、有荚膜的肠杆菌科细菌, 广泛存在于环境中, 亦寄生于人类的皮肤、鼻咽部、肠道等, 为条件致病菌, 主要感染免疫功能低下者[1]。1986年7例由KP引起的肝脓肿并发眼内炎首次被报道, 并被定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, HVKP)[2]。HVKP也可引起健康人群肝脓肿伴远处播散, 如眼内炎、坏死性筋膜炎、中枢神经系统感染等, 称为侵袭综合征[2-3]。此后, HVKP的报道在全球范围逐渐增多, 早诊断、早治疗可改善其感染的预后, 然而目前仍然缺乏确切的分子诊断标准和特异性分子标志物(不同文献之间所述标准不一), 对人类健康造成严重威胁。本研究对分离自本院的25株HVKP与28株普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumoniae, cKP)血清型和毒力基因分布特点进行比较分析, 探索HVKP的分子标志物, 期望对该病的分子诊断提供数据。
1 研究对象与方法 1.1 对象从复旦大学附属华山医院(2009―2018年)住院患者中, 根据临床病史和病原学检查结果, 筛选出侵袭综合征KP阳性患者(表 1), 从本院保存的菌库中获得相应的非重复KP菌株共25株, 将其视为HVKP组; 从菌库中随机抽取血流感染的KP菌株, 并根据病史剔除有合并其他侵袭性感染的菌株, 最终得到28株, 将其视为cKP组。
| 菌株编号 | 菌株来源 | 侵袭综合征表现 |
| KP1 | 血 | 肝脓肿、化脓性腰椎间盘感染、菌血症 |
| KP2 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、肺脓肿、菌血症 |
| KP3 | 血 | 肝脓肿、肺脓肿、泌尿系感染、菌血症 |
| KP4 | 脓液 | 肝脓肿、肺脓肿 |
| KP5 | 血 | 肝脓肿、皮肤软组织感染、肺部感染、菌血症 |
| KP6 | 血 | 肝脓肿、肺脓肿、菌血症 |
| KP7 | 脓液 | 肝脓肿、肺脓肿 |
| KP8 | 脓液 | 肝脓肿、肺脓肿 |
| KP9 | 脓液 | 肝脓肿、脑脓肿、肺部感染 |
| KP10 | 脓液 | 肝脓肿、肛周脓肿 |
| KP11 | 脓液 | 肝脓肿、皮肤软组织感染 |
| KP12 | 血 | 肝脓肿、腰大肌脓肿、菌血症 |
| KP13 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、菌血症 |
| KP14 | 血 | 肝脓肿、皮肤软组织感染、菌血症 |
| KP15 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、菌血症 |
| KP16 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、肺部感染、菌血症 |
| KP17 | 脓液 | 肝脓肿、中枢神经系统感染 |
| KP18 | 血 | 肝脓肿、中枢神经系统感染、菌血症 |
| KP19 | 脓液 | 肝脓肿、脑脓肿 |
| KP20 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、肺部感染、菌血症 |
| KP21 | 血 | 肝脓肿、眼内炎、菌血症 |
| KP22 | 血 | 肝脓肿、肺脓肿、菌血症 |
| KP23 | 血 | 肝脓肿、皮肤软组织感染、肺部感染 |
| KP24 | 血 | 颈部蜂窝织炎、化脓性椎间盘感染、菌血症 |
| KP25 | 血 | 皮肤软组织感染、菌血症 |
本研究关于HVKP组和cKP组的划分主要通过临床定义。据文献报道, HVKP引起的侵袭综合征主要表现为肝脓肿合并肝外侵袭性感染, 如眼内炎、坏死性筋膜炎、中枢神经系统感染等[3]。
血清型主要包括K1、K2、K5、K20、K54和K57[4-6]; 毒力基因包括[6-9]:①荚膜多糖合成和合成调控相关基因[10-11] wcaG和rmpA、rmpA2、magA; ②菌毛合成相关基因[12] fimH、mrkD; ③脂多糖相关基因[13] uge、wabG; ④铁摄取系统相关基因[14] aero、iucB、iutA、iroNB、ybtA、kfuBC; ⑤尿素酶相关基因[10] ureA、allS。
1.2 方法菌株进行复苏和培养, 采用Tiangen TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌株DNA。血清型和毒力基因的引物序列参照文献(表 2、表 3), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR体系20 μL: 1 μL DNA模板、0.5 μL引物R、0.5 μL引物F、10 μL Premix Taq (TaKaRa Premix Taq Version 2.0)、8 μL ddH2O。PCR条件:预变性95 ℃ 3 min; 变性95 ℃ 30 s, 退火(温度见表 2、3) 30 s, 延伸72 ℃ 1 min, 30个循环; 72 ℃维持10 min。PCR产物在1%浓度琼脂糖凝胶中电泳(电压120 V, 时间30 min), 经紫外成像仪拍照保存。
| Serotype | Sequence (5′-3′) | bp | Annealing(℃) | |
| K1[10] | K1-F | GGTGCTCTTTACATCATTGC | 1 283 | 58 |
| K1-R | GCAATGGCCATTTGCGTTAG | |||
| K2[10] | K2-F | GACCCGATATTCATACTTGACAGAG | 641 | 58 |
| K2-R | CCTGAAGTAAAATCGTAAATAGATGGC | |||
| K5[10] | K5-F | TGGTAGTGATGCTCGCGA | 280 | 58 |
| K5-R | CCTGAACCCACCCCAATC | |||
| K20[10] | K20-F | CGGTGCTACAGTGCATCATT | 741 | 58 |
| K20-R | GTTATACGATGCTCAGTCGC | |||
| K54[10] | K54-F | CATTAGCTCAGTGGTTGGCT | 881 | 58 |
| K54-R | GCTTGACAAACACCATAGCAG | |||
| K57[10] | K57-F | CCAGTAATCAGTCCAGAAACAACC | 1037 | 58 |
| K57-R | TAGCTTTTTTCATTCTTGTGTTTGTT |
| Virulence genes | Sequence(5′-3′) | bp | Annealing(℃) | |
| rmpA[15] | rmpA-F | ACTGGGCTACCTCTGCTTC | 516 | 58 |
| rmpA-R | CTTGCATGAGCCATCTTTCA | |||
| rmpA2[15] | rmpA2-F | TGTGCAATAAGGATGTTACATTAGT | 535 | 58 |
| rmpA2-R | TTTGATGTGCACCATTTTTCA | |||
| aero[15] | aero-F | GCATAGGCGGATACGAACAT | 556 | 49 |
| aero-R | CACAGGGCAATTGCTTACCT | |||
| wcaG[16] | wcaG-F | GGTTGGKTCAGCAATCGTA | 169 | 49 |
| wcaG-R | ACTATTCCGCCAACTTTTGC | |||
| allS[16] | allS-F | CCGAAACATTACGCACCTTT | 508 | 49 |
| allS-R | ATCACGAAGAGCCAGGTCAC | |||
| fimH[16] | fimH-F | TGCTGCTGGGCTGGTCGATG | 688 | 49 |
| fimH-R | GGGAGGGTGACGGTGACATC | |||
| uge[16] | uge-F | TCTTCACGCCTTCCTTCACT | 543 | 49 |
| uge-R | GATCATCCGGTCTCCCTGTA | |||
| wabG[16] | wabG-F | ACCATCGGCCATTTGATAGA | 683 | 49 |
| wabG-R | CGGACTGGCAGATCCATATC | |||
| ureA[16] | urea-F | GCTGACTTAAGAGAACOTTATG | 337 | 55 |
| urea-R | GATCATGGCGCTACCTCA | |||
| iutA[16] | iutA-F | GGCTGGACATCATGGGAACTGG | 300 | 55 |
| iutA-R | CGTCGGGAACGGGTAGAATCG | |||
| iroNB[16] | iroNB-F | GGCTACTGATACTTGACTATTC | 992 | 50 |
| iroNB-R | CAGGATACAATAGCCCATAG | |||
| ybtA[16] | ybtA-F | ATGACGGAGTCACCGCAAAC | 960 | 55 |
| ybtA-R | TTACATCACGCGTTTAAAGG | |||
| kfuBC[16] | kfuBC-F | GAAGTGACGCTGTTTCTGGC | 797 | 55 |
| kfuBC-R | TTTCGTGTGGCCAGTGACTC | |||
| mrkD[16] | mrkD-F | TTCTGCACAGCGGTCCC | 240 | 49 |
| mrkD-R | GATACCCGGCGTTTTCGTTAC |
应用SPSS 20.0进行统计学分析。分类变量用卡方检验做比较。对2组之间有显著差异的分子标志物分别计算其灵敏度、特异度、准确度和约登指数。应用二元Logistic回归(向后:LR)对分子标志物进行多因素分析, P＜0.05为有统计学差异。
2 结果 2.1 HVKP组中最常见的血清型为K1型HVKP组(25株)中最常见的血清型为K1型, 占60% (15/25);另外还检测到K2和K20各2株, 未测到血清型K5、K54和K57。HVKP组与cKP组相比, 血清型K1有统计学差异(χ2=9.983, P＜0.05), K2和K20虽然在统计学上无差异, 但这2种血清型只在HVKP组中测到(表 4)。
| Serotype | HVKP (n=25) |
cKP (n=28) |
χ2 | P |
| K1 | 15(60.00%) | 5(17.86%) | 9.983 | 0.002 |
| K2 | 2(8.00%) | 0 | - | 0.218 |
| K5 | 0 | 0 | - | - |
| K20 | 2(8.00%) | 0 | - | 0.218 |
| K54 | 0 | 0 | - | - |
| K57 | 0 | 0 | - | - |
HVKP组中毒力基因阳性率最高的前3种为uge、fimH和wabG, 分别占100%、96%和92%。与cKP组相比, 毒力基因有统计学差异的是rmpA2 (χ2=6.335, P=0.012)、magA (χ2=9.983, P=0.002)、fimH (χ2=9.389, P=0.002)、aero(χ2=6.692, P=0.010)、iutA(χ2=23.645, P=0.000)、kfuBC(χ2=14.018, P=0.000)。其他基因虽然在统计学上无差异, 但在HVKP组中基因的阳性率基本都高于cKP组。如果增大样本量, 可能会得到不同的结果(表 5)。
| Virulence genes | HVKP (n=25) |
cKP (n=28) |
χ2 | P |
| rmpA | 15(60.00%) | 13(46.43%) | 0.976 | 0.323 |
| rmpA2 | 20(80.00%) | 13(46.43%) | 6.335 | 0.012 |
| magA | 15(60.00%) | 5(17.86%) | 9.983 | 0.002 |
| wcaG | 9(36.00%) | 7(25.00%) | 0.758 | 0.384 |
| fimH | 24(96.00%) | 17(60.71%) | 9.389 | 0.002 |
| mrkD | 18(72.00%) | 16(57.14%) | 1.268 | 0.260 |
| uge | 25(100%) | 23(82.14%) | 3.061 | 0.080 |
| wabG | 23(92.00%) | 23(82.14%) | 0.425 | 0.515 |
| aero | 16(64.00%) | 8(28.57%) | 6.691 | 0.010 |
| iutA | 18(72.00%) | 2(7.14%) | 23.645 | 0.000 |
| iroNB | 4(16.00%) | 0 | 2.824 | 0.093 |
| ybtA | 23(92.00%) | 21(75.00%) | 1.636 | 0.201 |
| kfuBC | 20(80.00%) | 8(28.57%) | 14.018 | 0.000 |
| ureA | 22(88.00%) | 26(92.86%) | 0.018 | 0.894 |
| allS | 9(36.00%) | 6(21.43%) | 1.382 | 0.240 |
对HVKP与cKP组之间有显著差异的分子标志物, 分别计算其灵敏度、特异度、准确度和约登指数。根据约登指数将标志物的诊断效能由高到低排列:iutA＞kfuBC＞magA(K1)＞aero＞fimH＞rmpA2。经多因素Logistic回归分析, 发现iutA在HVKP与cKP组之间有统计学差异(P=0.002), 见表 6、表 7和图 1。
| Molecular markers | Accuracy(%) | Sensitivity(%) | Specificity(%) | Yoden index | OR(95% CI) |
| K1 | 71.7 | 60.0 | 82.1 | 0.421 | 6.900(1.967, 24.209) |
| rmpA2 | 66.0 | 80.0 | 53.6 | 0.336 | 4.615(1.350, 15.784) |
| magA | 71.7 | 60.0 | 82.1 | 0.421 | 6.900(1.967, 24.209) |
| fimH | 66.0 | 96.0 | 39.3 | 0.353 | 15.529(1.828, 131.902) |
| aero | 67.9 | 64.0 | 71.4 | 0.354 | 4.444(1.397, 14.138) |
| iutA | 52.8 | 72.0 | 92.9 | 0.649 | 33.429(6.215, 179.805) |
| kfuBC | 75.5 | 80.0 | 71.4 | 0.514 | 10.000(2.787, 35.885) |
| Molecular markers | B | S.E. | Wals | P | Exp(B) | 95% CI |
| K1 | 1.045 | 1.115 | 0.879 | 0.349 | 2.844 | 0.320, 25.282 |
| rmpA2 | -1.569 | 1.144 | 1.882 | 0.170 | 0.208 | 0.022, 1.960 |
| aero | -1.582 | 1.248 | 1.609 | 0.205 | 0.205 | 0.018, 2.370 |
| fimH | 2.067 | 1.272 | 2.644 | 0.104 | 7.900 | 0.654, 95.439 |
| iutA | 4.377 | 1.432 | 9.340 | 0.002 | 79.623 | 4.807, 1 318.947 |
| kfuBC | 0.473 | 1.075 | 0.194 | 0.660 | 1.605 | 0.195, 13.192 |
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| 图 1 HVKP分子标志物约登指数 Fig. 1 Yoden index of molecular markers in HVKP |
目前, 关于HVKP的分子标志物相关报道不多。本研究将侵袭综合征患者中分离的菌株视为HVKP, 单纯血流感染患者中分离的菌株视为cKP, 通过对既往所报道的KP血清型和毒力基因分别在HVKP组和cKP组中进行检测和比较, 筛选HVKP的分子标志物, 并评估其效能。
荚膜多糖是KP重要的毒力因子, 主要通过抗巨噬细胞吞噬作用、抑制早期炎症反应、抵抗抗菌肽和抑制树突细胞成熟帮助细菌免疫逃逸[6]。在目前发现的82种荚膜血清型中HVKP主要为K1、K2、K5、K20、K54和K57型[6-7, 16]。其中K1和K2型在亚洲地区常见[5-6], 血清型K1是亚洲地区最常见的血清型(21.7%), 在北美、欧洲和澳大利亚不常见[16]。研究表明K1型与侵袭综合征密切相关, K2型菌株毒力一般低于K1型。本研究中HVKP组K1型占60.00%, cKP组K1型占17.86%, 两者之间有统计学差异(χ2 =9.983, P=0.002)。除此之外, HVKP组中还检测到K2和K20型各2株, 虽然与cKP组之间无统计学差异, 这可能与样本量较小有关。本研究和既往研究结果较相符, 均表明K1型是HVKP最常见的血清型。
荚膜多糖K1型主要的调控基因是magA[17]。研究发现magA只存在于K1型KP菌株中, 而K1型被认为是HVKP的主要血清型[18]。magA与高黏力表型密切相关, 且该基因阳性的菌株往往在小鼠实验中表现出较高的毒力[19]。rmpA、rmpA2是荚膜多糖合成相关的转录调控因子基因, 可调控多种血清型合成, 形成高黏力表型[6, 20]。一般认为K1、K2型KP菌株高黏力表型多见, 其荚膜多糖合成调控基因rmpA和rmpA2阳性率也往往较高[5]。
本研究中HVKP组magA和rmpA2基因分别占60.00%和80.00%, 与cKP组之间有统计学差异, 可作为HVKP的重要分子标志物, 与其他研究结果一致[5]。然而, rmpA在HVKP组阳性率为60.00%, 在cKP组阳性率为46.43%, 虽然HVKP组阳性率高于cKP组, 但是在统计学上无差异, 与大部分文献报道不符。这可能是因为样本量太小, 若能增大样本量, 其更有说服力。但也有一些研究报道, 部分菌株rmpA、rmpA2均阳性却没有高黏力表现, 而且为低毒力, 可能与基因突变有关。
菌毛有助于细菌定植, 形成生物膜, T1P和T3P是KP的主要菌毛[6]。T1P由FimA和FimH组成, 可介导细菌与宿主细胞上含甘露糖的受体结合, 使细菌定植于泌尿生殖道、呼吸道、肠道等[6, 21]。T3P由MrkA和MrkD组成, 主要黏附于内皮细胞、呼吸道和尿路的上皮细胞[6]。本研究中, fimH在HVKP组中阳性率为96.00%, 在cKP组中阳性率为60.71%, 有统计学差异(χ2=9.389, P=0.002);而mrkD在HVKP组中阳性率为72.00%, 在cKP组中阳性率为57.14%, 无统计学差异(χ2=1.268, P=0.260)。虽然两者在HVKP和cKP组中阳性率均不低, 但是fimH比mrkD的特异性更强, 故fimH提示为HVKP的可能性更大。
铁对于细菌新陈代谢至关重要, 铁摄取系统是细菌重要的毒力分子机制。研究表明kfuBC编码铁摄取系统, 是KP重要的毒力因子[9, 20], 在K1、K2血清型的HVKP中多见[22]。本研究中kfuBC在HVKP组中阳性率为80.00%, 在cKP组中占28.57%, 两者差异较大(χ2=14.018, P=0.000), kfuBC可成为HVKP的分子标志物。
KP有4种铁载体——enterbactin、aerobactin、yersiniabactin和salmochelin, 其中enterbactin和aerobactin最为常见。有研究认为aerobactin是KP重要的毒力因子, 可使毒力增加100倍[6], 是HVKP常见的铁载体。它由aero编码合成, 而iutA则编码aerobactin的转运体, 转运螯合体进入细胞[23-24]。本研究中aero在HVKP组中阳性率为64.00%, 在cKP组中阳性率为28. 57%, 两者之间有统计学差异(χ2=6.691, P=0.010), 提示aero可作为HVKP分子标志物, 与既往文献报道相符。王等研究发现引起肝脓肿的毒力较高的KP菌株中aero阳性率超过90%[1]。小鼠实验发现, 低毒力、铁载体阴性的KP菌株经基因编辑插入aero后毒力明显增强, 而敲除aero的KP突变体毒力和侵袭性明显下降。这些研究都提示aero对KP毒力十分重要, aero阳性可在很大程度上提示高毒力[1, 25]。本研究中iutA基因在HVKP组中占72.00%, 而在cKP组中仅占7.14%, 同样差异明显(χ2=23.645, P=0.000), 说明iutA可作为HVKP的分子标志物。
铁载体中yersiniabactin在HVKP中可高达90%, 其转运体主要由ybtA编码; enterbactin经c-葡萄糖基修饰后成为salmochelin, 而iroNB是它的修饰基因。在本研究中yersiniabactin相关的ybtA基因在HVKP组的阳性率(92.00%)高于在cKP组的阳性率(75.00%), 但无统计学差异; enterbactin相关的iroNB基因在HVKP组的阳性率为16.00%, 而在cKP中未检测到, 可能该毒力基因与HVKP的高毒力有关, 但由于样本量较小, 在统计学上无差异。所以, 本研究中暂认为ybtA和iroNB基因不适合作为HVKP的分子标志物。
毒力基因wcaG与荚膜多糖合成相关, 编码合成细菌荚膜中岩藻糖成分, 有助于逃逸巨噬细胞的吞噬作用[10]。但本研究中wcaG基因在2组的阳性率均不高, 在HVKP组占36.00%, 在cKP组占25.00%, 故认为wcaG可能不适合作为HVKP的分子标志物。
脂多糖由O抗原、核心多糖和脂质组成, 是KP重要的毒力因素[6]。wabG是脂多糖核心多糖的合成酶基因之一, uge是UDP-半乳糖醛酸酯异构酶编码基因, 与脂多糖合成相关。本研究结果显示, wabG在HVKP组中占92.00%, 在cKP组中占82.14%, uge在HVKP组中阳性率为100%, 在cKP组中为82.14%, 两者阳性率均较高, 且无明显差异, 不适合作为HVKP的特异性分子标志物。
尿素酶催化尿素分解为氨和二氧化碳, 为细菌生长提供氮源[6]。基因簇ureABCDEFG编码尿素酶, 其中ureA、ureB和ureC是其主要的结构亚基[26]。allS编码尿囊素调节子激活剂, 同时也与铁载体aerobactin生成相关[10, 26]。本研究中ureA阳性率在HVKP组(88.00%)和cKP组(92.86%)差异不大(χ2=0.018, P=0.894);基因allS的阳性率不高, 在HVKP组(36.00%)中阳性率高于cKP组(21.43%), 但是无统计学差异(χ2=1.382, P=0.240)。ureA和allS基因不适合作为HVKP的分子标志物。
本研究存在的一些不足之处:①样本量较小, 若扩大样本量, 结论可能会发生改变。比如部分试验数据表明一些毒力基因和血清型阳性率在HVKP组中高于cKP组, 但在统计学上无显著差异, 若能增大样本量, 可能会得到不同的结果。②HVKP为临床定义, 即为引起侵袭综合征的KP菌株, 未通过动物实验对其高毒力进行验证, 研究缺乏足够的严谨性。③虽然本文在选择cKP菌株时对临床病例资料进行了筛选, 只选择单纯血流感染的病例, 剔除合并其他部位侵袭性感染的病例, 减少了混入HVKP组的风险, 但并不能完全将其笼统地归为cKP组。
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