布鲁菌属(Brucellae)细菌所致的布鲁菌病是一种严重威胁人体健康和生产活动的人畜共患病。布鲁菌共有12个种^[1], 分别是羊种(B. melitensis)、猪种(B. suis)、牛种(B. abortus)、绵羊种(B. ovis)、犬种(B.canis)和沙林鼠种(B. neotomae); 由海洋动物分离的鳍种(B. ceti)和鲸种(B. pinnipedialis)^[2]; 土壤中分离的田鼠种(B. microti)^[3]; 乳房移植物中分离的湖浪布鲁菌(B.inopinata)^[4]; 红狐中分离的B.vulpis^[5]和竹子中分离的B. papionis^[6]。近年来, 在两栖动物蛙中发现新的布鲁菌^[5]。各种间在核酸水平上有90%以上的相似性^[7]。目前, 布鲁菌的鉴定、分型分别在核酸水平和生化水平进行, 即对布鲁菌可疑菌落的多价抗血清凝集试验, 二氧化碳需求试验, 硫化氢产生试验, 单因子血清A、R和M的凝集试验, 以及噬菌体的特异性裂解反应^[7-8]; bcsp31基因和IS711插入序列的PCR鉴定^[9-10], 多重PCR(如AMOS等用于种的分析)^[11-12]。目前还没有一种分子分型系统可以覆盖布鲁菌的全部种和型, 噬菌体裂解实验在布鲁菌鉴定中依然具有不可替代的作用。布鲁菌噬菌体的参考品在改变其增殖菌后, 获得噬菌体突变体^[13], 即使相同的噬菌体, 也会得出不完全一致的分型结果^[14]。因此, 噬菌体的生物学特性直接影响其宿主特异性和裂解活性。本文就布鲁菌噬菌体的生物学特性进行综述。

1 布鲁菌噬菌体的组成、形态特征及分型作用

20世纪50―60年代发现了噬菌体对布鲁菌的感染和裂解作用^[15-16]。1950年Tbilisi (Tb)噬菌体由B. abortus 141菌株培养分离到, 由疫苗株S19 (B. abortus)传代培养, 是最早用于分型的布鲁菌噬菌体, 到20世纪80年代形成了由Tb、Firenze (Fi)、Weybridge (Wb)、Berkeley 2 (Bk₂)、R/C和Izatnagar (Iz)组成的噬菌体参考品^{[8, 17]}, 被世界各地实验室沿用至今。后来分离到的噬菌体突变体, 如S708、F1、F25、Np、NMg-1和NMg-2等, 作为分型系统的补充, 也被用于布鲁菌的鉴定^{[13, 18-21]}, 大部分噬菌体由表面抗原为光滑型脂多糖的B. abortus、B. suis和B. melitensis分离到^{[14, 20, 22-24]}, 裂解粗糙型布鲁菌的噬菌体来源于实验室裂解光滑型布鲁菌噬菌体^{[14, 17]}。

布鲁菌噬菌体是线性非包膜双链DNA病毒, 均具有短尾噬菌体科的形态, 电子显微镜下观察到一个直径50~80 nm的二十面体头和一个宽10~15 nm、长7~9 nm的非收缩性尾^[25]。布鲁菌噬菌体之间具有很近的亲缘关系^[19], 属于同一物种^{[22, 26]}, 因此, 有些布鲁菌噬菌体具有几乎相同的宿主特异性^[23]。

噬菌体不同株在布鲁菌6个种和非典型布鲁菌的鉴定中起着重要作用。噬菌体的参考品在常规检测浓度(routine test dilution, RTD)下裂解布鲁菌产生噬斑, 通常采用RTD和10⁴×RTD的噬菌体悬液对粗糙型和光滑型布鲁菌进行鉴定、分型^{[8, 27]}, 其缺点是不能区分噬菌体增殖菌和被自外裂解(lysis from without)杀死的细菌, 后者因细菌吸附大量噬菌体颗粒而导致细胞壁破坏^[17]。6种噬菌体的参考品均不能裂解B. inopinata; 除R/C不裂解B.ceti外, 其余5种噬菌体可抑制B. ceti的生长, 但噬菌体本身不发生增殖^[28]。此外, 噬菌体的突变体也具有一定的鉴定、分型作用, 如崔等^[21]采用诱变和纯化方法, 将分离到的布鲁菌噬菌体SA(对犬种菌有低裂解活性)培育成对犬种布鲁菌具有较高裂解活性的噬菌体NMg-1和NMg-2, 对变异B. melitensis的鉴定具有满意的效果。Morris等发现A422和M51噬菌体在B. suis上均可产生噬斑^[14], 所以噬菌体参考品以外新发现的噬菌体可作为分型系统的补充, 使某些布鲁菌的区分更可靠。

2 布鲁菌噬菌体的生长特性

噬菌体对布鲁菌的分型反应由吸附率和感染率决定。Tb在B. abortus中培养具有很高的吸附率和感染率, 并产生大而清晰的噬斑; Tb在B. neotomae中仅有一半细菌被1个或多个噬菌体颗粒裂解, 部分细菌经过感染周期释放的噬菌体颗粒只产生小而清晰的噬斑; B. suis则需要更多的Tb颗粒来裂解, 不发生复制也没有噬斑产生; 在B. melitensis中, 抑制菌苔的生长则需要更多的Tb颗粒。B. abortus除了被Tb吸附形成空斑外, 还会出现一种只吸附但不发生裂解的中间状态, 通过延长潜伏期, 有一部分细菌被感染并释放成熟的噬菌体颗粒, 在噬菌体出现自然突变前, 被感染的培养物或菌落形态看起来是正常的, 当Tb发生突变后宿主菌变得白而黏, 而且突变体比亲代噬菌体能更有效地穿透细胞壁, 更快地繁殖^[29]。

噬菌体在不同的增殖菌中吸附时间、吸附率、裂解时间及颗粒释放数有所不同。Tb以B. abortus S19和B. abortus 141为饲养菌, 吸附时间分别为180和190 min, 平均释放颗粒数分别为50~53 PFU/cell和40~46 PFU/cell。另外, 不同的噬菌体在B. abortus 141中生长情况也不同, 噬菌体544的吸附时间在90~100 min, 其他噬菌体如110、141、11sa、1066、281、177、V等则在120~190 min; 吸附率最高达98%, 最低为37%, 集中在70%~90%;各种噬菌体在宿主菌中的潜伏期为180~300 min; 裂解时间在400~490 min; 平均释放颗粒数最高为110~120 PFU/cell, 最低为18~20 PFU/cell, 集中在25~65 PFU/cell^[30]。在B. abortus 544中对Tb的生长特性进行了实验, 发现其吸附时间和潜伏期分别为90 min和120 min, 裂解时间在180~240 min, 颗粒释放量为34~40 PFU/cell。因此, 噬菌体的生长特性与其宿主菌密切相关。

3 布鲁菌噬菌体的宿主范围

布鲁菌噬菌体可以在哪些菌中增殖以及改变增殖菌是否影响其裂解特异性, 与其宿主范围有关。可以被Tb和Fi裂解的布鲁菌株比较接近, 两者不同之处在于Tb裂解B. suis 1330, 而Fi则否^[30], 但相关报道亦存在分歧, 有报道Tb在RTD浓度时不裂解B. suis 1330, 也有的称Tb和Fi两者均可产生噬斑^{[19, 29, 31]}; 另一分歧是Tb能否对B. melitensis 16M裂解^{[19, 28]}。为了解不同增殖菌对噬菌体裂解特性的影响, Hammerl等采用不同的饲养菌对Tb、Wb、R/C和Iz进行增殖, 未发现噬菌体的裂解特性受到影响, 也没有观察到噬菌体适应新的宿主菌, 如噬菌体R/C保持了对粗糙型宿主感染的特异性和唯一性; 即使在不同宿主菌中增殖可能会引起噬菌体基因的改变, 然而此改变与其宿主范围的改变没有必然联系^[30]。但是, 改变宿主菌后噬菌体释放的颗粒数会受到较大影响, 因此, 分型用噬菌体的增殖、鉴定、浓度及对照的选择应依据相应的标准严格执行, 改变其中某个条件很可能出现不同结果。如果同一噬菌体因滴度不同而引起结果差异, 使用相同的饲养菌增殖噬菌体可以避免这种差异; 若出现相反的分型结果, 很可能是噬菌体发生了基因突变, 建议对其基因组进行测序^[28]。

4 布鲁菌噬菌体的溶源现象

溶源现象是由于噬菌体的基因组重组到宿主染色体中, 引起溶源性细菌在形态和生理特性方面发生改变, 导致对同类噬菌体及其近缘噬菌体的侵染具有免疫性。感染Tb后存活下来的B. abortus S19, 经过多次传代后PCR可检测到最初的培养物中仍有其存在, 然而经丝裂霉素C处理后没有观察到噬菌体颗粒的释放^{[28, 32]}; 另外, 电子显微镜下观察到Tb颗粒吸附到细菌表面, 但是再次培养检测不到噬菌体, 这说明B. abortus S19可能是Tb的载体, 但没有完整的噬菌体基因组插入细菌染色体中, 也没有观察到携带Tb的细菌对相同或不同的布鲁菌标准噬菌体感染具有免疫力^[33-34]。在对一株光滑型牛种布鲁菌变异菌分型时, Tb在RTD和10⁴×RTD均不能裂解该菌, 基因组测序未发现噬菌体基因组的整合。超薄电子显微镜下观察切片, 该菌有Tb吸附, 但未见噬菌体侵入菌体^[35], 其原因有待进一步研究。

B. abortus S19的派生物S19lys含有温和噬菌体BiPBO1, Tb对溶源性菌株S19lys和原菌株具有相同的裂解作用, 说明S19lys中的温和噬菌体BiPBO1不会影响Tb在S19lys中的裂解和增殖, Tb和BiPBO1在裂解S19lys时由于形成不同形态的噬斑可将两者区分^[32]。因此, 前噬菌体的存在可被噬菌体感染所诱导, 布鲁菌噬菌体裂解产物应考虑溶源现象。

综上所述, 噬菌体裂解实验在布鲁菌分型中应严格按规范进行操作, 使用公认的参考品作为对照是保证分型结果正确的重要前提, 噬菌体与其宿主菌相互作用、相互制约, 处于动态变化中, 这也是一个共进化过程, 值得深入探索和研究。