2020, Vol. 15
2. 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司, 芜湖 241000;
3. 安徽医科大学第二临床医学院, 合肥 230060;
4. 安徽医科大学临床病毒学研究所, 合肥 230032
2. Wuhu Interfell Research Institute, Wuhu 241000, Anhui Province, China;
3. Second Clinical Medical College of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China;
4. Institute of Clinical Virology, Anhui Medical University, Hefei 230000, Anhui Province, China
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)为双链DNA病毒，属疱疹病毒α亚科。VZV主要通过呼吸道传播，在人类原发感染时可引起水痘并在人脊髓神经节中终身潜伏，当宿主免疫力低下时病毒可再次被激活导致带状疱疹(herpes zoster, HZ)[1, 2]。HZ在我国年发病率约为3.4/1 000~5.8/1 000[3]，并且在50岁以上人群中发病率急剧上升[4]。HZ导致的后遗神经痛等并发症严重影响患者的生活质量[5]，而且目前无治疗HZ特效药，临床上以对症治疗为主。VZV糖蛋白E(glycoprotein E，gE)由开放阅读框(open reading frames，ORF)68基因编码，全长为1 872 bp，其N端第1~544氨基酸残基为含有信号肽的胞外域[6]，第121~135氨基酸残基为产生中和抗体的抗原表位[7]。gE为病毒包膜和感染细胞膜上含量最丰富的糖蛋白[8]，具有促进病毒复制增殖以及介导病毒在细胞间传播的功能[9]。gE基因序列高度保守，抗原性稳定并且具有很强的免疫原性[10, 11]，是VZV亚单位疫苗的主要候选蛋白。
葛兰素史克(GlaxoSmithKline, GSK)公司的VZV gE亚单位疫苗Shingrix于2017年获得美国食品药品监督管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批准用于预防带状疱疹，其在临床试验中获得良好的预防效果，这说明采用gE亚单位疫苗具有可行性和优越性。Shingrix由于使用真核表达系统(中国仓鼠卵巢细胞)生产，其产量较低、价格较高。我国2019年5月批准Shingrix疫苗在中国上市，但到目前为止仍未见广泛使用。目前采用原核表达系统表达的重组VZV gE蛋白均为包涵体形式，故后续工艺需要变复性处理，操作步骤较复杂，且变复性可能影响该蛋白的结构与活性。因此，研究重组VZV gE蛋白原核可溶性表达可充分发挥原核表达系统工艺简单、成本低等优势，为VZV gE亚单位疫苗研制提供一种新的方案。
伊兴旭等[12]通过原核表达系统以包涵体形式表达的重组VZV gE蛋白具有一定的特异性，免疫家兔可得到相应特异性较强的多克隆抗体。因此在参考其研究的基础上，本研究通过分析VZV gE第31~539氨基酸残基信号肽、亲水性等理化性质和抗原表位后，采用VZV gE去除信号肽的胞外域序列，以原核表达系统构建并表达重组gE蛋白，进一步鉴定其免疫反应性及产生抗体的特异性，期望对VZV gE亚单位疫苗研制提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 材料大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞、人胚成纤维细胞(HF)、非洲绿猴肾(Vero)细胞、VZV(OKA株)、人巨细胞病毒(HCMV，AD169株)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV) 1型(HSV-1，F株)及HSV-2型(HSV-2，Sav株)均为本实验室保存。6~8周龄BALB/c小鼠(SPF级，体重22~25克/只)购自安徽医科大学动物实验中心。pET32a-VZV gE重组质粒由安徽省滁州通用生物公司合成。限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ购自大连Takara公司。小鼠抗VZV gE单克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自美国Invitrogen公司；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)购自北京索莱宝科技有限公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国SIGMA公司。含有氨苄西林(ampicillin, Amp+)的琼脂培养基为本实验室制备。质粒提取试剂盒购自美国AXYGEN公司。EtEraserTM HP内毒素去除试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技有限公司。荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司。蛋白纯化仪(AKTA)购自上海宸乔生物科技有限公司，Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱和HiPrepTM Q FF 16/10阴离子交换预装柱购自美国GE公司，0.45 μm针形滤器购自美国Millipore公司，酶标仪(iMark)购自美国Bio-Rad公司，化学发光成像仪(ChemiScope 5200)购自上海勤翔科学仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 VZV gE胞外域生物信息学分析基因序列来源于美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)ID:1487709，在伊兴旭等[12]的研究基础上，去除第1~30氨基酸序列，目的基因大小1 527 bp。引物设计：Sense：5′-GCCTTACTACCATTCAGATC-3′；Antisense：5′-GTGTATGCTACGGCTTCA-3′。用ExPASy在线工具(www.expasy.org)分析VZV gE第31~539氨基酸残基序列的信号肽、跨膜区、疏水性及三级空间结构，通过德泰生物在线工具(www.detaibio.com)预测其抗原表位。
1.2.2 BL21/pET32a-VZV gE工程菌构建及鉴定将10 μL pET32a-VZV gE重组质粒转化至100 μL BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴45 min后置42 ℃水浴热激90 s，热激完成后冰浴3~5 min。加入1 mL的溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)培养液，置摇床37 ℃温浴1 h，离心去除上清液，将转化后的感受态细胞接种至含Amp+琼脂培养基平皿上。37 ℃培养12~16 h后，挑取单菌落接种到含Amp+液体LB培养基中扩增培养。根据质粒提取试剂盒说明书提取质粒后进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)及双酶切，并交由北京六合华大基因科技有限公司测序鉴定。PCR体系为25 μL，包括1 μL pET32a-VZV gE质粒模板，Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL和RNase free H2O 10.5 μL。PCR程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共39个循环；最后72 ℃延伸10 min。双酶切反应体系为：质粒模板15 μL，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶各1.5 μL，10×QuickCut缓冲液2 μL，用RNase free H2O配制成终体积为20 μL体系，37 ℃反应1 h。
1.2.3 重组gE蛋白诱导表达及可溶性检测将BL21/pET32a-VZV gE重组菌置于LB液体培养基(Amp+)中37 ℃培养至OD600值为0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，30 ℃诱导，分别在第2、4、6、8、10、12 h收集1 mL菌液，12 000 rpm离心收集沉淀物，300 μL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)重悬，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和Gis软件分析检测重组gE蛋白表达情况。重组菌扩增培养至OD600值等于0.6~0.8时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG诱导8 h，7 000 r/min离心20 min，使用PBS重悬菌体，冰浴超声破碎菌体，12 000 r/min离心5 min分离上清液和沉淀物，分别取上清液、沉淀物及破碎前菌体经SDS-PAGE检测重组gE蛋白的可溶性。
1.2.4 重组gE蛋白纯化、去内毒素以及特异性检测将重组菌超声破碎，12 000 r/min离心5 min，取上清液后，使用His-tag亲和层析柱对重组gE蛋白进行纯化后，将收集洗脱下的目的蛋白溶液去除内毒素，即取VZV gE蛋白溶液置于20倍柱体积PBS中，4 ℃透析6 h以上。采用HiPrepTM Q FF 16/10预装柱，超纯水冲洗层析柱至出液端液体pH值为中性。平衡缓冲液(50 mmol/L乙酸钠，pH=5.0)平衡层析柱，再使用冰乙酸快速调节重组gE蛋白纯化产物pH值至5.0±0.2，12 000 r/min离心5 min后收集上清液。经0.45 μm针形滤器过滤后，过HiPrepTM Q FF 16/10预装柱去除内毒素，待UV 280 nm吸收值开始上升时收样，收集流穿液，即为去除内毒素后的重组gE蛋白。采用EtEraserTM HP内毒素去除试剂盒，按照操作方法检测该重组蛋白溶液的内毒素含量。以蛋白质印迹法(Western blot, WB)鉴定其特异性，即以小鼠抗VZV gE单克隆抗体(1∶4 000稀释)为一抗，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶50 000稀释)为二抗，37 ℃孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。最后使用化学发光成像仪观察结果。
1.2.5 重组gE蛋白的多克隆抗体制备实验用6~8周龄SPF级BALB/c小鼠50只，体重为22~25克/只，随机平均分为5组(组号：1、2、3、4、5)。免疫前小鼠尾静脉采血保存作为阴性血清对照。初次免疫时，每只小鼠腹腔注射0.2 mL由弗氏完全佐剂乳化的纯化gE抗原(蛋白浓度为1.0 mg/mL)。第3和第5周以弗氏不完全佐剂乳化的纯化抗原进行免疫，最后以无佐剂纯化抗原再进行2次免疫，每次间隔2周。每次免疫后1周内经小鼠眼眶静脉采血，分别收集血清备用。
1.2.6 酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体水平采用由棋盘滴定法确定的重组gE抗原最适包被浓度1.0 μg/mL包被酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)板。设阴性对照组(免疫前小鼠血清)和空白对照组，实验组以系列稀释的小鼠抗血清(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600)作为一抗，每个稀释度设置3个复孔，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；以1∶10 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min，PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；加入100 μL/孔TMB显色液在常温避光显像15 min后，加入终止液终止反应。酶标仪测定各标本双波长450 nm和630 nm校准后的OD值，计算阴性对照组OD值的平均值(x)和标准差(s)，判定实验组各组标本OD值< x+3s为阴性，OD值≥x+3s为阳性。
1.2.7 间接免疫荧光法检测多克隆抗体的特异性将HF细胞和Vero细胞分别接种至12孔细胞培养板中，待细胞长满单层，分别取VZV、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染HF细胞，HSV-1、HSV-2感染Vero细胞，置37 ℃、5%CO2温箱培养。待出现病毒特征性致细胞病变后，用固定液(甲醛与丙酮体积比为1∶1)固定细胞，室温作用10 min，PBS洗涤3次，每次5 min(以下各步骤间均用相同方法洗涤)；1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)处理细胞10 min，10%小牛血清封闭1 h；以1∶500稀释的小鼠抗血清作为一抗，37 ℃孵育1 h；然后用1∶4 000稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，37 ℃孵育1 h；加入0.5 μg/mL DAPI在室温染色10 min，洗涤、盖片，置荧光显微镜下观察结果。
1.2.8 统计学分析采用SPSS18.0软件进行数据分析，用%表示定性数据，用x±s表示定量数据，采用配对t检验。
2 结果 2.1 VZV gE第31~509氨基酸残基为亲水蛋白且抗原表位丰富使用ExPASy在线工具分析VZV gE第31~539氨基酸残基信号肽、跨膜区、三级结构和亲水性，使用德泰生物在线工具预测该序列抗原表位。结果表明，该序列不含信号肽序列和跨膜区；其三级结构由规则的空间构象组成，包括多个β折叠和无规则卷曲(图 1A)；对该序列进行亲水性预测发现，它由509个氨基酸残基组成，只有少数疏水区域，预测结果为亲水蛋白；同时得到gE第31~539氨基酸残基抗原表位预测信息，即该全长序列中有丰富的抗原表位且位点的抗原指数较高(图 1B)。
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| A: Tertiary structure prediction of recombinant gE protein. B: Prediction of antigen epitopes of recombinant gE protein. 图 1 重组gE蛋白三级结构和抗原表位预测 Fig. 1 Tertiary structure and epitope prediction of recombinant gE protein |
将BL21/pET32a-VZV gE工程菌扩增培养，提取质粒进行PCR和双酶切后，交由北京六合华大基因科技有限公司测序鉴定。鉴定结果显示，pET32a-VZV gE重组质粒中含有去除第1~30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因序列。
2.3 重组gE蛋白可溶性表达检测重组菌经1 mmol/L IPTG诱导后，通过电泳图谱分析发现，随着诱导时间的延长，重组gE蛋白表达量不断增加，在第8小时时表达量趋向峰值，条带为43.07%(图 2A)。重组菌经超声破碎后，取上清液和沉淀物进行SDS-PAGE分析。结果发现，在上清液样本泳道中，相对分子质量(molecular weight, MW)约77.6×103处出现明显的目的条带，而沉淀物样本中目的条带较浅，表明重组gE蛋白主要为可溶性表达(图 2B)。
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| A: SDS-PAGE detected the expression of recombinant gE protein induced at different time. M: Protein Marker 26610; 1: BL21/pET32a-VZV gE recombinant bacteria before induction; 2-7: Followed by inducted 2, 4, 6, 8, 10 and 12 h. B: The expression of recombinant gE protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis. M: Protein Marker 26610; 1: BL21/pET32a-VZV gE recombinant bacteria before induction; 2: Recombinant bacteria were not lysised after induction; 3: Supernatant of bacterial lysates; 4: Precipitation of bacterial lysates. 图 2 重组gE蛋白诱导表达及可溶性检测 Fig. 2 Induced expression and soluble detection of recombinant gE protein |
重组gE蛋白纯化并去除内毒素后，经检测内毒素含量 < 5 EU/mL。经SDS-PAGE鉴定和Gis软件分析，该重组蛋白溶液的纯度约90%(图 3A)。进一步采用以小鼠抗VZV gE单克隆抗体(1∶4 000稀释)为一抗的WB技术进行鉴定，结果显示纯化的重组gE蛋白实验组在MW约为77.6×103处出现明显的优势条带，提示重组gE蛋白具有较强的特异性(图 3B)。
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| A: SDS-PAGE results of recombinant gE protein purified product. M: Protein marker 26610; 1: BL21/ pET-32a negative control; 2: Recombinant gE protein purified product. B: Results of WB identification of recombinant gE protein purified product. M: Protein marker26616; 1: BL21/pET-32a negative control; 2: Recombinant gE protein purified product. 图 3 重组gE蛋白纯化产物特异性检测 Fig. 3 The specificity of purified product of recombinant gE protein was determined |
ELISA检测结果显示，临界值为阴性对照组 x+3s(0.164+0.022)。在经过5次免疫后，实验组各组OD值大于临界值时相对应的重组gE特异性多克隆抗体效价可达1∶12 800~1∶25 600(表 1)。
| Group | Mouse number | Immunization | ||||
| First | Second | Third | Fourth | Fifth | ||
| Experience group | 1 | 0 | 200 | 800 | 3 200 | 12 800 |
| 2 | 0 | 400 | 1 600 | 6 400 | 25 600 | |
| 3 | 0 | 200 | 1 600 | 3 200 | 12 800 | |
| 4 | 0 | 400 | 1 600 | 6 400 | 25 600 | |
| 5 | 0 | 400 | 800 | 6 400 | 12 800 | |
| ENegative control group | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 | 200 | 0 | 0 | |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Blank control group | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| The experimental group was immunized with recombinant gE protein, the negative control group was the serum of mice before immunization with recombinant gE protein, and the blank control group was not added with mouse serum.Three complex holes were set for each sample, and the results were averaged. Antibody titer(1∶x). | ||||||
制备VZV和HCMV感染的HF细胞片及HSV-1、HSV-2感染的Vero细胞片，以重组gE抗原免疫小鼠制备的相应特异性多克隆抗体作为一抗(1∶500稀释)、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG作为二抗(1∶4 000稀释)进行间接免疫荧光染色反应。结果显示，VZV感染的HF细胞膜呈现典型的绿色荧光着色；而其他疱疹病毒感染的细胞膜均未出现绿色荧光信号(图 4)。这提示用重组gE蛋白制备的多克隆抗体具有高度特异性。
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| A: Normal HF cells and cells were infected with VZV or HCMV AD169 respectively; normal Vero cells and cells were infected with HSV-1 or HSV-2 respectively. B: HF cells were infected with VZV, and each panel shows DAPI (left), Alexa Fluor488 labeled goat anti-mouse IgG (middle) fluorescence signals, as well as a merge (right). C: HCMV-infected HF cells, HSV-1 infected Vero cells and HSV-2 infected Vero cells were stained with DAPI (upper) or Alexa Fluor488 labeled goat anti-mouse IgG (lower) respectively. Scale bar is 50 μm. 图 4 抗VZV gE多克隆抗体特异性检测 Fig. 4 The specificity of anti-VZV gE polyclonal antibodies was determined by indirect immunofluorescence |
VZV gE胞外域主要含有3个抗原表位，分别位于第56~75、第86~105和第116~135氨基酸残基[13]。在原核表达系统中，gE蛋白N端的信号肽因无法被相应受体识别而失去其作用，并且其疏水性可能会导致gE蛋白的错误折叠从而影响蛋白表达。在pET32a质粒中，Trx含有原核表达系统的信号肽且对人体无毒副作用[14]。因此，采用去除信号肽的gE胞外域序列构建的BL21/pET32a-VZV gE重组菌可能有助于重组gE蛋白重要抗原表位的可溶性表达。这可能是本研究所获目的蛋白能够保持较高免疫原性的原因之一。但本次实验数据处理时，未对临界值附近标本进行重复检测，这是此次实验研究中存在的不足，今后还将进一步改进和完善。
HZ多发于老年人以及免疫缺陷患者，细胞免疫功能的降低是HZ发病的重要因素[15]。gE丰富表达于VZV和其感染的细胞表面，是VZV特异性CD4+T细胞反应的主要靶点[16]。VZV gE亚单位疫苗Shingrix良好的临床免疫效果得益于其使用的AS01B佐剂能够有效协助抗原诱导产生VZV gE特异性CD4+T细胞，从而引发细胞免疫应答[17, 18]。所以国产VZV gE亚单位疫苗的研发应当重视不同的佐剂产生的效力，有效的佐剂不仅在先期接种时强化疫苗产生的免疫效果，同时有助于提高机体的免疫记忆能力，使机体随着年龄增长仍能保持对VZV特异性免疫应答能力。
真核表达系统具有磷酸化和糖基化等修饰功能[19, 20]，可提高蛋白的活性和免疫原性，但由于其生产周期长和成本高等因素的限制，目前上市的VZV疫苗Shingrix产能相对不足。由于我国每年有近300万人受HZ影响，使得疫苗的需求压力较大，尽快研发出国产疫苗迫在眉睫。本研究构建的原核系统表达的重组gE蛋白在保持其有较强的免疫原性的同时，还具备工艺相对简单、生产成本低、可大规模发酵和工业化生产等优势[21]，这为后期能够大规模工业化生产VZV gE亚单位疫苗奠定了基础。
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