2021, Vol. 16
2. 广西中医药大学基础医学院, 广西南宁 530200
2. School of Basic Medical Science, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang autonomous region, China
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)属于革兰氏阴性菌，在不同环境中例如土壤、水体、植物和动物中都有发现。P. aeruginosa属于人类常见的条件致病菌，在健康人体的皮肤、口腔、呼吸道、肠道等部位都有少量存在。当人体出现免疫力严重下降、长期使用广谱抗生素、大面积外伤或者需要长期使用气管插管等医疗设备等情况时，铜绿假单胞菌可大量增殖成为主要的致病菌。目前，P. aeruginosa已经成为医院内细菌感染的最常见的病原菌，可导致皮肤、呼吸道、消化道、泌尿道和骨髓等部位的感染，给病人造成很大的损害。临床上采用抗生素治疗P. aeruginosa感染，常使用的抗生素有妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南、头孢哌酮舒巴坦、环丙沙星等。由于细菌外膜通透性低、耐药外排泵的作用、耐药基因广泛存在以及生物被膜(biofilm)形成等原因，P. aeruginosa可对多种抗生素产生耐药性。一项针对386株P. aeruginosa临床分离菌株的耐药性分析发现，氯霉素的耐药性高达94%，氨苄青霉素和羧苄青霉素的耐药性分别为76.5%和53.7%，头孢类抗生素如头孢唑林、头孢呋肟的耐药性也高达89%和65%[1]。除了耐药性问题，P. aeruginosa引发的感染很难靠人体自身免疫系统彻底清除，急性感染可转化为慢性感染且无法彻底治愈，这与P. aeruginosa可以合成多种毒性因子来抑制甚至破坏人体免疫系统密不可分，生物被膜的形成也阻碍了抗体和免疫细胞对其内部细菌的清除[2]。非抗生素治疗方法是采用除抗生素之外的其他化学物质、生物活性成分或者生物体对致病菌毒性进行抑制或者清除菌体的新方法。该方法不需要使用抗生素，不会产生耐药性问题，因而受到日益重视。多种非抗生素治疗方法取得了不错的效果，被寄予厚望。非抗生素治疗形式非常多样，本文主要对抗原抗体免疫疗法、噬菌体疗法、抗毒力因子疗法的基本概念、研究新进展和存在问题等进行论述。
1 抗原抗体免疫疗法人体在受到病原菌感染时，免疫系统是最主要的防御系统，采用接种疫苗来预防和治疗病原菌感染是常规医疗手段。早期的研究已表明，P. aeruginosa侵袭人体时，免疫系统(包括固有免疫应答和适应性免疫应答)被激活[3]。P. aeruginosa感染多数发生在患者免疫能力下降的情况下，此时通过自身免疫力很难将菌体有效清除从而造成免疫逃逸。通过抗原或抗体来治疗P. aeruginosa感染一直是科学家的梦想，但是至今尚未有一种P. aeruginosa疫苗或抗体上市。针对P. aerugin-osa感染的疫苗或抗体研究也主要停留在动物实验阶段，虽有少量的疫苗或抗体进入临床实验阶段，但因其安全性和有效性还存在很多问题而进展缓慢。目前用于P. aeruginosa疫苗开发的主要的抗原有菌体、胞外蛋白、脂多糖和多糖。
1.1 菌体疫苗关于P. aeruginosa菌体疫苗的研究报道比较少，采用菌体制备的疫苗又可根据菌体的存活与否分成灭活疫苗和减毒疫苗。Cripps等[4]使用甲醛制备了灭活的全菌体疫苗，经过30人的临床Ⅰ期实验，证明该疫苗是安全的，并且可产生显著的免疫应答：接种疫苗后，血清中特异性IgA、IgM均显著增加，而IgG的含量没有变化，这提示该疫苗未能有效激活胸腺依赖性的免疫应答，目前未见报道该疫苗新的进展。减毒活疫苗相比于灭活疫苗具有免疫活性强的优势。Priebe等[5]构建了P. aeruginosa PAO1菌株的aroA突变株，aroA是P. aeruginosa致病性的关键基因，aroA的缺失会导致P. aeruginosa的致病性下降；利用aroA突变株以鼻腔免疫法处理小鼠，实验结果显示，该减毒活疫苗可以产生良好的免疫保护作用，并且是安全的[5]。因为活疫苗相对于灭活疫苗具有更大的风险，尚未见该疫苗开展人体临床实验的报道。
1.2 胞外蛋白抗体蛋白质具有良好的免疫原性，可以激活人体的免疫系统产生特异性抗体并且具有较高的安全性，因此在近些年利用P. aeruginosa胞外蛋白来制备抗体的研究非常多，也取得了不错的进展。研究较多的胞外蛋白有：外膜蛋白(OprF、OprI、OprL)、鞭毛蛋白(FliC)、Pili菌毛蛋白(PilA和PilQ)以及Ⅲ型分泌系统蛋白(PopB和PcrV)等[6]。已经有不少胞外蛋白抗体进入临床实验研究，例如由MedImmune公司研制的MedI3902抗体，它是特异性针对Ⅲ型分泌系统蛋白PcrV和胞外多糖Psl的双价抗体[7-8]。临床前研究结果表明，MedI3902抗体能保护多种动物在肺炎和烧伤中避免P. aeruginosa感染，并且是安全的。目前，该抗体已经完成临床Ⅰ期实验，安全性测试证明了其在健康成年人中的安全性[9]。Vienna公司研制的IC43(又称VLA43)抗体是利用外膜蛋白OprF和OprI融合蛋白制备的单克隆抗体。临床前研究的小鼠实验中，IC43抗体可诱导多重免疫反应[10]；临床Ⅰ期研究的结果发现IC43抗体没有严重的副作用，在后期的临床研究中发现该抗体虽然可降低P. aer-uginosa感染病人的死亡率，但是有效性尚不理想，目前该项目已经被停止[6]。
1.3 脂多糖、胞外多糖疫苗和抗体脂多糖是细菌外膜的主要成分之一，又被称为内毒素，因其可引起很强的免疫反应，故可作为抗原制备疫苗。Pier等[11]发现P. aeruginosa的脂多糖可激活人体的免疫系统，但直接采用脂多糖作为抗原注射人体会导致发热等副作用。如何改造脂多糖以降低其毒副作用并同时保留其免疫特异性和高效性是脂多糖疫苗开发所面临的主要难点，用脂质体包装脂多糖可有效降低其副作用[12]。
胞外多糖是细菌分泌到细胞外的一类多糖类物质，P. aeruginosa胞外多糖主要有海澡酸盐alginate, pel和psl，其中采用alginate和psl作为抗原研制抗体已有不少报道[8, 13]。Aridis公司研制的AR-105抗体是以alginate为抗原的单克隆抗体，目前已进入临床实验，但尚未见其最新的研究进展[9]。纯化的胞外多糖免疫活性通常不高，不能有效诱导机体产生足够的抗体。常见的解决方法是将胞外多糖与蛋白质交联获得复合物从而增强免疫反应。
抗原抗体免疫疗法的研究已经进行了约半个世纪，从近些年几种疫苗或抗体的临床实验研究来看，其针对大规模人群的免疫效果并不能让人满意，这也是至今为止尚未有一款疫苗或抗体上市的主要原因。P. aeruginosa疫苗或抗体开发难度大的可能原因是P. aeruginosa具有易突变能力和易形成生物被膜进而带来的强适应能力，导致仅靠激活人体的免疫系统无法有效清除菌体。当然这并不能阻止抗原抗体免疫疗法继续发展，随着更有效的抗原被开发，以及最新出现的免疫细胞疗法等新技术的应用，这个领域的突破还是令人期待的。
2 噬菌体疗法采用噬菌体来治疗细菌感染的想法在噬菌体被发现的早期就已经被提出，并开展了一定的研究，但随着抗生素的广泛使用，该研究领域进展缓慢。近些年随着多重耐药菌的出现，噬菌体疗法被重新重视，利用噬菌体治疗耐药性细菌感染的研究不断增多，表现出巨大的潜力[14]。
利用噬菌体治疗P. aeruginosa感染已经有不少研究结果。Mcvay等[15]采用小鼠烧伤模型研究了三种P. aeruginosa噬菌体通过三种途径(肌肉注射、皮下注射和腹腔注射)治疗P. aeruginosa感染。结果显示噬菌体治疗显著提高了受感染小鼠的生存率，其中腹腔注射的方式最为有效(存活率由对照组的6%提高到87%)。成伏波等[16]采用噬菌体疗法治疗烧伤并感染P. aeruginosa的小鼠，发现噬菌体治疗具有显著疗效。噬菌体治疗对多重耐药P. aeruginosa感染具有独特优势，它不仅可以裂解菌体还可以增加菌体对多种抗生素的敏感性[17]。已经有研究表明采用噬菌体和抗生素联合治疗要比单独使用两种治疗方案效果好的多[18]。另外，P. aeruginosa容易在体内形成生物被膜并发展成慢性感染，而噬菌体可以对生物被膜内的菌体进行杀伤[19]，这一研究发现对P. aeruginosa慢性感染的治疗具有重要意义。
目前噬菌体治疗研究主要处于动物实验阶段，只有少量研究进入临床。Rhoads等[20]采用噬菌体治疗由P. aeruginosa等细菌导致的慢性下肢静脉溃疡(Ⅰ期临床研究)，39位患者在12周的治疗期间和随后的24周治疗后随访期间未出现安全问题。然而采用噬菌体治疗P. aeruginosa感染还有不少问题需要解决，例如安全性和治疗效果需要更多的证据支持；P. aeruginosa可以通过突变的方式对噬菌体产生抗性，如何避免这种情况发生都需要深入的研究。
总的来说，噬菌体疗法作为一种独具特色的非抗生素疗法具有巨大的应用潜力，特别是在治疗P. aeruginosa多重耐药菌感染时，该疗法可以特异性杀死靶标菌株而不对人体内其他的菌群产生严重破坏，毒副作用小。但是，其高度的菌株特异性又限制了噬菌体疗法成为一种广泛的抗P. aeruginosa疗法。随着对噬菌体和P. aeruginosa之间相互关系的分子机制的深入研究，在不久的将来有望采用基因工程手段改造噬菌体，使其可以识别并杀灭患者体内不同类型的P. aeruginosa菌株。
3 抗毒力因子疗法P. aeruginosa在感染人体时可以合成并释放一些物质，这些物质对细菌在人体中的适应和繁殖具有重要作用，同时也是给人体组织造成损害的主要物质，它们被称为毒力因子。目前，P. aeruginosa的毒力因子已经被深入研究，研究较多的毒力因子有alginate、外毒素A(ToxA)、绿脓菌素(pyocya-nine)、荧光铁载体(pyoverdine)、弹性蛋白酶(elastase)、蛋白水解酶(protease)、鼠李糖脂(rhamnolipid)等。通过各种抑制剂抑制毒力因子的合成与分泌从而降低P. aeruginosa对人体的损伤或协助人体免疫系统清除菌体，这种新的治疗方法被称为抗毒力因子疗法。区别于抗生素疗法，抗毒力因子疗法不对细菌的生长产生明显抑制作用，因此不容易产生抗药性等问题。
目前，抗毒力因子疗法的治疗靶标主要集中在群体感应系统、生物被膜和Ⅲ型分泌系统。
3.1 群体感应及其抑制剂群体感应(quorum sensing, QS)是细菌通过自身合成的化学信号分子彼此交流并共同调控基因表达的现象。目前研究最为详细的是在革兰氏阴性菌中广泛存在的LuxI-LuxR系统，该系统的化学信号分子为酰化高丝氨酸内酯(acyl-ho-moserine lactone，AHL)。P. aeruginosa中存在三套QS系统：LasI-LasR系统、RhlI-RhlR系统和PQS系统。其中LasI-LasR系统与RhlI-RhlR系统的信号分子分别为3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-oxododecanoyl-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL)和丁基酰高丝氨酸内酯(butryl-homoserine lactone，C4-HSL)，两者都属于AHL类化合物，而PQS的信号分子是2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quino1one)[21]。
QS对P. aeruginosa多种毒力因子的合成以及生物被膜的形成具有重要调节作用，QS系统的功能缺失导致细菌的致病性显著下降。采用QS抑制剂来降低毒力因子合成和生物被膜形成已成为具有巨大潜力的治疗方案，目前QS抑制剂的研究成为治疗P. aeruginosa感染的热点[22]。QS抑制剂的作用方式主要有：①阻断信号分子与其受体的结合；②降解信号分子；③抑制信号分子的合成等[23]。在已报道的多种类型的QS抑制剂中，AHL受体拮抗剂备受关注，这类抑制剂多数在结构上与AHL相似，可以竞争性结合LasR或RhlR，从而阻断QS信号传导[24]。QS抑制剂除包含小分子化合物外，还包含多种AHL降解酶，这些酶在动、植物体内以及真菌、细菌中都被发现，它们可以使AHL失去活性，又被称为QS淬灭酶[25]。
虽然QS抑制剂具有很大的应用前景，但很少有QS抑制剂被用于P. aeruginosa感染的临床治疗。有一个例外就是抗生素阿奇霉素，阿奇霉素并不能杀灭P. aeruginosa，但可以抑制菌体蛋白质和毒力因子的合成[26]。目前，阿奇霉素被广泛应用于慢性阻塞性肺气肿、支气管扩张或者肺部囊性纤维化伴P. aeruginosa慢性呼吸道感染患者的治疗。QS抑制剂的研究主要还集中在临床前的体外实验阶段；动物模型的体内研究已取得了不错的进展，例如Brackman等[27]采用线虫感染模型研究，发现天然产物黄芩苷作为P. aeruginosa的QS抑制剂单独使用时可以提高感染线虫的存活率，与妥布霉素联合使用要比单独使用妥布霉素或黄芩苷的治疗效果好得多。大蒜提取物被发现可抑制P. aeruginosa的QS，有效成分大蒜烯可协助妥布霉素对P. aeruginosa中的生物被膜菌体进行杀伤，并显著提高小鼠体内的P. aeruginosa清除率[28]。目前仅有少量报道QS抑制剂用于治疗P. aeruginosa的临床研究，例如Smyth等[29]采用大蒜提取液对26名P. aeruginosa慢性感染伴肺部囊性纤维化的患者进行临床实验，结果提示，与安慰剂组相比，大蒜提取液实验组的患者未见显著性改善，这说明利用QS抑制剂治疗P. aeruginosa感染还需要进一步的研究。
3.2 生物被膜及其抑制剂绝大多数细菌在自然环境中并不是以游离单细胞的形式存在，而是多个细胞聚集在一起并包埋在由细菌合成与分泌的胞外基质中，这种特定的三维立体结构被称为生物被膜。在患者体内，P. aeruginosa一旦形成生物被膜，对多种抗生素的耐药性大幅增加，导致利用传统抗生素治疗非常难以治愈[30]。从临床检验的耐药性分析来看，具有生物被膜形成能力的P. aeruginosa菌株的耐药性在悬浮自由生长状态下并不具有很强的耐药性。在菌体形成生物被膜时，导致耐药性大幅增强的主要原因有：①生物被膜具有物理屏障作用，胞外基质成分可以阻止抗生素进入生物被膜内部；②生物被膜深层的细菌生理状态相比于悬浮菌体发生了非常大的变化，主要表现在生长繁殖的速度下降，代谢活性降低，而目前临床上使用的抗生素主要是针对处于生长代谢旺盛的细菌才具有较高的杀伤能力，生物被膜内部近似休眠状态的细菌对抗生素抵抗力大幅增加。此外，生物被膜形成与细菌毒力因子的合成与分泌具有密切联系。P. aeruginosa的生物被膜形成过程中会合成并分泌alginate、鼠李糖脂等毒力因子，这些毒力因子可以杀死免疫细胞或者阻止免疫细胞对菌体的清除[31-32]。鉴于生物被膜对P. aeruginosa耐药性和致病性的影响，生物被膜抑制剂的相关研究备受关注。生物被膜抑制剂可以干扰多个过程发挥抑制作用。①抑制菌体的运动和黏附作用。例如有研究发现亚抑菌浓度的大环内酯类抗生素克拉霉素能显著抑制P. aeruginosa的蹭行运动(twitching motility)和改变生物被膜的结构[33]。②干扰胞外凝集素、脂多糖、胞外蛋白、胞外多糖等物质的合成、降解或功能发挥。LecB是位于P. aeruginosa外膜的凝集素，参与生物被膜的形成[34]；最近Sommer等[35]发现多糖类似物可以结合LecB并抑制LecB的功能，从而降低生物被膜的形成。Alkawash等[36]发现alginate裂解酶可以破坏黏性生物被膜的完整性，增强生物被膜内菌体对抗生素的敏感性。③诱导生物被膜发生解体。Barraud等[37]发现亚抑菌浓度的一氧化氮(nitric oxide, NO)可以介导P. aeruginosa的生物被膜发生解体，并且发现NO可以增强多种抗生素对生物被膜的杀伤效果。④通过QS系统抑制生物被膜形成。因为QS对生物被膜形成具有正调控作用，不少研究发现QS抑制剂可以抑制生物被膜的形成[38-39]。
生物被膜抑制剂的研究主要处于临床前的体外研究和动物实验阶段，只有少量生物被膜抑制剂进入临床研究。例如，Howlin等[40]采用低剂量NO辅助治疗肺部囊性纤维化合并P. aeruginosa感染患者，在临床实验设计中，NO处理组有6名患者，给予头孢他啶和妥布霉素结合10 ppm的NO进行治疗，而对照组只采用头孢他啶和妥布霉素治疗。结果显示，NO处理组病人体内P. aeruginosa的生物被膜数量明显下降。
3.3 Ⅲ型分泌系统及其抑制剂在P. aeruginosa的毒力因子中有一类比较特殊的蛋白质，被称为外毒素或效应蛋白，外毒素可以被特定的分泌系统转运到细胞内发挥毒性作用。目前已经发现的外毒素有ToxA、ExoS、ExoU、ExoT和ExoY等。P. aeruginosa的分泌系统可以分成Ⅰ-Ⅵ共6类，其中Ⅲ型分泌系统在P. aeruginosa感染人体过程中发挥重要作用；由Ⅲ型分泌系统分泌的外毒素包含ExoS、ExoU、ExoT以及ExoY。
目前发现至少43个基因参与了Ⅲ型分泌系统的组建和功能发挥，包括外毒素、装置蛋白、转运蛋白和伴侣蛋白等。鉴于Ⅲ型分泌系统在P. aeruginosa感染人体中发挥至关重要的作用，以及近些年在Ⅲ型分泌系统结构、调控以及致病机制研究方面取得了重大进展，该系统已成为极具潜力的药物靶标，其抑制剂研究也取得了迅速的发展。
Ⅲ型分泌系统抑制剂根据其作用机制大致可分为3类。①转录抑制剂。P. aeruginosa与宿主细胞接触后，Ⅲ型分泌系统相关基因的转录被激活，其中ExsA是关键的转录因子[41]。Marsden等[42]发现N-羟基苯并咪唑能够结合ExsA，并抑制它的转录激活活性，从而降低细胞毒性作用。②外毒素抑制剂。E-xoU是P. aeruginosa Ⅲ型分泌系统分泌的毒性最大的外毒素，它的磷脂酶A2活性可造成宿主细胞坏死[43], P. aeruginosa ExoU突变株相比于野生株引起小鼠感染形成的脓肿显著缩小[44]。Kim等[45]通过筛选化合物库获得了对ExoU酶活性抑制率高的化合物，这类化合物属于磺胺类药物。③针管状结构蛋白的抑制剂。针管状结构是Ⅲ型分泌系统将外毒素转运至细胞的蛋白质复合体，位于细菌的外表面。筛选针管状结构抑制剂就可进一步对抑制其分泌与转运功能进行研究。Aiello等[46]发现了一类特异性抑制Ⅲ型分泌系统的化合物苯氧乙酰胺，但它的作用靶标尚不清楚。Bowlin等[47]研究发现Ⅲ型分泌系统的结构组成蛋白PscF发生突变后，苯氧乙酰胺不再能抑制Ⅲ型分泌系统的分泌功能，从而证明了苯氧乙酰胺的靶标就是PscF。PcrV是位于针管状结构尖端的转运蛋白，近些年关于PcrV的研究取得了不少进展，PcrV可以控制菌体通过Ⅲ型分泌系统分泌外毒素[48]。针对PcrV抑制剂的研究目前集中在单克隆抗体的研发，多个实验室证明了PcrV抗体在小鼠感染模型中发挥良好的作用。Imamura等[49]用小鼠模型实验发现了PcrV抗体能减少急性和慢性P. aeruginosa肺部感染所致的菌血症，对脓毒性休克的组织炎症也有良好的治疗效果。管章春等[50]制备了PcrV单克隆抗体，并证明PcrV抗体确实可以抵抗P. aeruginosa感染，降低小鼠的死亡率。当前，已经有数个PcrV抗体进入临床研究，例如Psl/PcrV抗体(MEDI3902)[7-9]。
综上所述，Ⅲ型分泌系统抑制剂的研究取得了不错的进展，但是大部分研究仍处于临床前的体外实验或动物实验阶段，仅少量的抑制剂进入临床研究，例如PcrV抗体，目前尚未有抑制剂进入临床应用阶段。
抗毒力因子疗法在实际的临床应用中还有不少难题有待解决，例如P. aeruginosa的毒力因子种类众多，其表达调控异常复杂，在不同人体内和不同菌株中毒力因子的种类和数量存在很大差异，这提示需要根据患者情况和菌株的特异性来个性化考虑其所需的抑制剂组合。此外，目前众多毒力因子抑制剂在实际的临床实践中表现如何以及对人体有何毒副作用都需要继续深入探究。总之，抗毒力因子疗法是对传统抗生素杀灭病原菌思路的一种突破，是一种旨在降低病原菌的侵害作用和改善患者生活状态的新疗法，在未来的抗感染治疗中将占有重要地位。
4 讨论虽然抗生素治疗在应对P. aeruginosa感染时面临诸多问题，但它依然是目前最主要的治疗手段，这种现状短时间内不会发生变化，因为大量的临床应用证明了抗生素治疗对大部分的P. aeruginosa感染患者依旧是安全和有效的。随着新型抗生素研发速度逐渐减慢，而细菌耐药性问题不断突出，寻找有效的非抗生素治疗方案显得越来越紧迫。近些年，针对P. aeruginosa感染的非抗生素疗法迅速发展，但是大量的研究还主要集中在临床前的实验室研究阶段，少量进入临床研究的方案也因其有效性不理想或者不稳定而仍须加以改进或者不得不被终止，因此尚未有非抗生素疗法作为主要治疗手段被临床采用。
随着大量P. aeruginosa相关疫苗、抗体或抑制剂的实验室研究和临床研究的深入开展，非抗生素治疗的安全性和有效性等问题将不断被解决。针对抗原抗体免疫疗法，如何获得更多、更有效的抗原是关键问题。通过对P. aeruginosa的基因组学、蛋白质组学以及代谢组学进行深入研究，进而筛选优势抗原并探索最佳抗原组合已成为研究新方向。此外，提高疫苗的表达效率，深入研究疫苗的免疫机制和不良反应，都是提高免疫疗法安全性和有效性的必要手段。鉴于目前的临床研究结果，短时间内抗原抗体免疫疗法难以被广泛应用，针对P. aeruginosa抗体和疫苗研究何时突破瓶颈尚无法判断。从近些年已进入临床研究的抗体和疫苗分布来看，其主要集中在国外的机构或公司，未见有中国研究机构或公司的身影[6]，这说明我国在此领域应该加大科技投入。
噬菌体疗法是一种潜力巨大的非抗生素疗法，由于抗生素疗法的主导地位导致噬菌体疗法在多数国家被禁止，但是目前仍有少量国家如波兰和格鲁吉亚批准使用。我国在噬菌体疗法方面的研究比较多，中国人民解放军陆军医大学、中国科学院武汉病毒研究所、武汉大学、天津科技大学等都有一批专家开展噬菌体疗法研究，但尚停留在临床前期的实验研究阶段，需要在临床研究方面取得突破进展。噬菌体治疗中特定噬菌体对侵染菌株的高度特异性使得在开发噬菌体制剂过程中，如何使开发的噬菌体高效识别并杀伤不同患者体内多样的P. aeruginosa菌株成为亟待需要解决的难题，而这方面的研究十分缺乏。针对不同患者体内的P. aeruginosa菌株个性化选择特定的噬菌体可能是提高治疗疗效的好方法。另外，P. aeruginosa的突变进化将导致对噬菌体产生抗性的菌株出现，这种产生抗性的分子机制以及应对措施也是不可忽视的重要问题[51]。
在抗毒性因子疗法中，针对QS和Ⅲ型分泌系统抑制剂的研究最多，目前的研究主要集中在体外研究，随着更多的抑制剂进入临床研究，这些抑制剂与抗生素的联合作用值得深入探讨，这是因为QS和Ⅲ型分泌系统在P. aeruginosa感染患者的过程中容易受到环境因素特别是抗生素使用种类以及使用浓度的影响。P. aeruginosa的QS系统非常复杂，目前发现的3套主要的QS系统在感染人体过程中的功能尚不完全清楚，例如在患者体内常分离到las系统、rhl系统或PQS系统的突变株，实验室的体外研究结果也提示了这3种QS系统的功能冗余现象，此外是否还存在新的QS系统也不清楚[52]。这些新的发现使得QS抑制剂用于P. aeruginosa感染的治疗存在不少争议。
对于P. aeruginosa重度感染者，即使采用积极的抗生素疗法也依然存在很高的死亡率，对这些患者率先采用个性化的非抗生素疗法辅助治疗具有重要的现实意义。总之，在不久的将来，非抗生素疗法作为一类具有巨大发展潜力的治疗方法有望在抗感染领域占有一席之地。
| [1] |
邢应如, 蒋金. 铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性分析[J]. 实用全科医学, 2003, 1(2): 90-91. [DOI]
|
| [2] |
Jensen PØ, Givskov M, Bjarnsholt T, Moser C. The immune system vs. Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2010, 59(3): 292-305.
[DOI]
|
| [3] |
Hoiby N. Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. Relationship between mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa and the humoral immune response[J]. Acta Pathol Microbiol Scand B Microbiol Immunol, 1974, 82(4): 551-558.
[URI]
|
| [4] |
Cripps AW, Peek K, Dunkley M, Ventto K, Marjason JK, McIntyre ME, Sizer P, Croft D, Sedlak-Weinstein L. Safety and immunogenicity of an oral inactivated whole-cell Pseudomonas aeruginosa vaccine administered to healthy human subjects[J]. Infect Immun, 2006, 74(2): 968-974.
[DOI]
|
| [5] |
Priebe GP, Brinig MM, Hatano K, Grout M, Coleman FT, Pier GB, Goldberg JB. Construction and characterization of a live, attenuated aroA deletion mutant of Pseudomonas aeruginosa as a candidate intranasal vaccine[J]. Infect Immun, 2002, 70(3): 1507-1517.
[DOI]
|
| [6] |
Merakou C, Schaefers MM, Priebe GP. Progress toward the elusive Pseudomonas aeruginosa vaccine[J]. Surg infect, 2018, 19(8): 757-768.
[DOI]
|
| [7] |
Sato H, Frank DW. Multi-functional characteristics of the Pseudomonas aeruginosa type Ⅲ needle-tip protein, PcrV; comparison to orthologs in other gram-negative bacteria[J]. Front Microbiol, 2011, 2: 142.
[DOI]
|
| [8] |
Jones CJ, Wozniak DJ. Psl produced by mucoid Pseudomonas aeruginosa contributes to the establishment of biofilms and immune evasion[J]. mBio, 2017, 8(3): e00864-17.
[DOI]
|
| [9] |
Ali SO, Yu XQ, Robbie GJ, Wu Y, Shoemaker K, Yu L, DiGiandomenico A, Keller AE, Anude C, Hernandez-Illas M, Bellamy T, Fallon J, Dubovsky F, Jafri HS. Phase 1 study of MEDI3902, an investigational anti-Pseudomonas aeruginosa PcrV and Psl bispecific human monoclonal antibody, in healthy adults[J]. Clin Microbiol Infect, 2019, 25(5): 629. e1-629. e6.
[DOI]
|
| [10] |
Westritschnig K, Hochreiter R, Wallner G, Firbas C, Schwameis M, Jilma B. A randomized, placebo-controlled phase I study assessing the safety and immunogenicity of a Pseudomonas aeruginosa hybrid outer membrane protein OprF/I vaccine (IC43) in healthy volunteers[J]. Hum vaccin immunother, 2014, 10(1): 170-183.
[DOI]
|
| [11] |
Pier GB. Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity[J]. Int J Med Microbiol, 2007, 297(5): 277-295.
[DOI]
|
| [12] |
Bennett-Guerrero E, McIntosh TJ, Barclay GR, Snyder DS, Gibbs RJ, Mythen MG, Poxton IR. Preparation and preclinical evaluation of a novel liposomal complete-core lipopolysaccharide vaccine[J]. Infect immun, 2000, 68(11): 6202-6208.
[DOI]
|
| [13] |
Pier GB, DesJardin D, Grout M, Garner C, Bennett SE, Pekoe G, Fuller SA, Thornton MO, Harkonen WS, Miller HC. Human immune response to Pseudomonas aeruginosa mucoid exopolysaccharide (alginate) vaccine[J]. Infect Immunity, 1994, 62(9): 3972-3979.
[DOI]
|
| [14] |
Jennes S, Merabishvili M, Soentjens P, Pang KW, Rose T, Keersebilck E, Soete O, François PM, Teodorescu S, Verween G, Verbeken G, De Vos D, Pirnay JP. Use of bacteriophages in the treatme of colistin-only-sensitive Pseudomonas aeruginosa septicaemia in a patient with acute kidney injury-a case report[J]. Crit Care, 2017, 21(1): 129.
[DOI]
|
| [15] |
McVay CS, Velásquez M, Fralick JA. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(6): 1934-1938.
[DOI]
|
| [16] |
成伏波, 郑文旭, 李菁华, 刘晓彬, 孙延波, 徐德启. 噬菌体疗法对烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗作用[J]. 中国感染与化疗杂志, 2009, 9(1): 18-21. [DOI]
|
| [17] |
Vieira A, Silva YJ, Cunha A, Gomes NC, Ackermann HW, Almeida A. Phage therapy to control multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa skin infections: In vitro and ex vivo experiments[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(11): 3241-3249.
[DOI]
|
| [18] |
Oechslin F, Piccardi P, Mancini S, Gabard J, Moreillon P, Entenza JM, Resch G, Que YA. Synergistic interaction between phage therapy and antibiotics clears Pseudomonas aeruginosa infection in endocarditis and reduces virulence[J]. J Infect Dis, 2017, 215(5): 703-712.
[DOI]
|
| [19] |
Mapes AC, Trautner BW, Liao KS, Ramig RF. Development of expanded host range phage active on biofilms of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa[J]. Bacteriophage, 2016, 6(1): e1096995.
[DOI]
|
| [20] |
Rhoads DD, Wolcott RD, Kuskowski MA, Wolcott BM, Ward LS, Sulakvelidze A. Bacteriophage therapy of venous leg ulcers in humans: results of a phase I safety trial[J]. J Wound Care, 2009, 18(6): 237-238.
[DOI]
|
| [21] |
Venturi V. Regulation of quorum sensing in Pseudomonas[J]. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30(2): 274-291.
[DOI]
|
| [22] |
Whiteley M, Diggle SP, Greenberg EP. Progress and promise of bacterial quorum sensing research[J]. Nature, 2017, 551(7680): 313-320.
[DOI]
|
| [23] |
Veesenmeyer JL, Hauser AR, Lisboa T, Rello J. Pseudomonas aeruginosa virulence and therapy: evolving translational strategies[J]. Crit Care Med, 2009, 37(5): 1777-1786.
[DOI]
|
| [24] |
O'Loughlin CT, Miller LC, Siryaporn A, Drescher K, Semmelhack MF, Bassler BL. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2013, 110(44): 17981-17986.
[DOI]
|
| [25] |
Murugayah SA, Gerth ML. Engineering quorum quenching enzymes: progress and perspectives[J]. Biochem Soc Trans, 2019, 47(3): 793-800.
[DOI]
|
| [26] |
Tateda K, Comte R, Pechere JC, Köhler T, Yamaguchi K, Vun Delden C. Azithromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(6): 1930-1933.
[DOI]
|
| [27] |
Brackman G, Cos P, Maes L, Nelis HJ, Coenye T. Quorum sensing inhibitors increase the susceptibility of bacterial biofilms to antibiotics in vitro and in vivo[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(6): 2655-2661.
[DOI]
|
| [28] |
Jakobsen TH, van V, Gennip M, Phipps RK, Shanmugham MS, Christensen LD, Alhede M, Skindersoe ME, Rasmussen TB, Friedrich K, Uthe F, Jensen PØ, Moser C, Nielsen KF, Eberl L, Larsen TO, Tanner D, Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(5): 2314-2325.
[DOI]
|
| [29] |
Smyth AR, Cifelli PM, Ortori CA, Righetti K, Lewis S, Erskine P, Holland ED, Givskov M, Williams P, Cámara M, Barrett DA, Knox A. Garlic as an inhibitor of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing in cystic fibrosis-a pilot randomized controlled trial[J]. Pediatr Pulmonol, 2010, 45(4): 356-362.
[DOI]
|
| [30] |
Høiby N, Bjarnsholt T, Moser C, Jensen PØ, Kolpen M, Qvist T, Aanaes K, Pressler T, Skov M, Ciofu O. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients[J]. APMIS, 2017, 125(4): 339-343.
[DOI]
|
| [31] |
May TB, Shinabarger D, Maharaj R, Kato J, Chu L, DeVault JD, Roychoudhury S, Zielinski NA, Berry A, Rothmel RK. Alginate synthesis by Pseudomonas aeruginosa: a key pathogenic factor in chronic pulmonary infections of cystic fibrosis patients[J]. Clin Microbiol Rev, 1991, 4(2): 191-206.
[DOI]
|
| [32] |
Dössel J, Meyer-Hoffert U, Schröder JM, Gerstel U. Pseudomonas aeruginosa-derived rhamnolipids subvert the host innate immune response through manipulation of the human beta-defensin-2 expression[J]. Cell Microbiol, 2012, 14(9): 1364-1375.
[DOI]
|
| [33] |
Wozniak DJ, Keyser R. Effects of subinhibitory concentrations of macrolide antibiotics on Pseudomonas aeruginosa[J]. Chest, 2004, 125(2 Suppl): 62S-69S.
[DOI]
|
| [34] |
Tielker D, Hacker S, Loris R, Strathmann M, Wingender J, Wilhelm S, Rosenau F, Jaeger KE. Pseudomonas aeruginosa lectin LecB is located in the outer membrane and is involved in biofilm formation[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 5): 1313-1323.
[DOI]
|
| [35] |
Sommer R, Wagner S, Rox K, Varrot A, Hauck D, Wamhoff EC, Schreiber J, Ryckmans T, Brunner T, Rademacher C, Hartmann RW, Brönstrup M, Imberty A, Titz A. Glycomimetic, orally bioavailable LecB inhibitors block biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Am Chem Soc, 2018, 140(7): 2537-2545.
[DOI]
|
| [36] |
Alkawash MA, Soothill JS, Schiller NL. Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosa in biofilms[J]. APMIS, 2006, 114(2): 131-138.
[DOI]
|
| [37] |
Barraud N, Hassett DJ, Hwang SH, Rice SA, Kjelleberg S, Webb JS. Involvement of nitric oxide in biofilm dispersal of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Bacteriol, 2006, 188(21): 7344-7353.
[DOI]
|
| [38] |
Brackman G, Coenye T. Quorum sensing inhibitors as anti-biofilm agents[J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(1): 5-11.
[DOI]
|
| [39] |
Maura D, Rahme LG. Pharmacological inhibition of the Pseudomonas aeruginosa MvfR quorum-sensing system interferes with biofilm formation and potentiates antibiotic-mediated biofilm disruption[J]. Antimicrob Agents Chemotherapy, 2017, 61(12): e01362-17.
[DOI]
|
| [40] |
Howlin RP, Cathie K, Hall-Stoodley L, Cornelius V, Duignan C, Allan RN, Fernandez BO, Barraud N, Bruce KD, Jefferies J, Kelso M, Kjelleberg S, Rice SA, Rogers GB, Pink S, Smith C, Sukhtankar PS, Salib R, Legg J, Carroll M, Daniels T, Feelisch M, Stoodley P, Clarke SC, Connett G, Faust SN, Webb JS. Low-dose nitric oxide as targeted anti-biofilm adjunctive therapy to treat chronic Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis[J]. Mol Ther, 2017, 25(9): 2104-2116.
[DOI]
|
| [41] |
Yahr TL, Wolfgang MC. Transcriptional regulation of the Pseudomonas aeruginosa type Ⅲ secretion system[J]. Mol Microbiol, 2006, 62(3): 631-640.
[DOI]
|
| [42] |
Marsden AE, King JM, Spies MA, Kim OK, Yahr TL. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa ExsA DNA-binding acticity by N-hydroxybenzimidazoles[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 60(2): 766-776.
[DOI]
|
| [43] |
Sato H, Frank DW, Hillard CJ, Feix JB, Pankhaniya RR, Moriyama K, Finck-Barbançon V, Buchaklian A, Lei M, Long RM, Wiener-Kronish J, Sawa T. The mechanism of action of the Pseudomonas aeruginosa-encoded type Ⅲ cytotoxin, ExoU[J]. EMBO J, 2003, 22(12): 2959-2969.
[DOI]
|
| [44] |
Berube BJ, Murphy KR, Torhan MC, Bowlin NO, Williams JD, Bowlin TL, Moir DT, Hauser AR. Impact of type Ⅲ secretion effectors and of phenoxyacetamide inhibitors of type Ⅲ secretion on abscess formation in a mouse model of Pseudomonas aeruginosa infection[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(11): e01202-17.
[DOI]
|
| [45] |
Kim D, Baek J, Song J, Byeon H, Min H, Min KH. Identification of arylsulfonamides as ExoU inhibitors[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2014, 24(16): 3823-3825.
[DOI]
|
| [46] |
Aiello D, Williams JD, Majgier-Baranowska H, Patel I, Peet NP, Huang J, Lory S, Bowlin TL, Moir DT. Discovery and characterization of inhibitors of Pseudomonas aeruginosa type Ⅲ secretion[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(5): 1988-1999.
[DOI]
|
| [47] |
Bowlin NO, Williams JD, Knoten CA, Torhan MC, Tashjian TF, Li B, Aiello D, Mecsas J, Hauser AR, Peet NP, Bowlin TL, Moir DT. Mutations in the Pseudomonas aeruginosa needle protein gene pscF confer resistance to phenoxyacetamide inhibitors of the type Ⅲ secretion system[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(4): 2211-2220.
[DOI]
|
| [48] |
Lee PC, Stopford CM, Svenson AG, Rietsch A. Control of effector export by the Pseudomonas aeruginosa type Ⅲ secretion proteins PcrG and PcrV[J]. Mol Microbiol, 2010, 75(4): 924-941.
[DOI]
|
| [49] |
Imamura Y, Yanagihara K, Fukuda Y, Kaneko Y, Seki M, Izumikawa K, Miyazaki Y, Hirakata Y, Sawa T, Wiener-Kronish JP, Kohno S. Effect of anti-PcrV antibody in a murine chronic airway Pseudomonas aeruginosa infection model[J]. Eur Respir J, 2007, 29(5): 965-968.
[DOI]
|
| [50] |
管章春, 刘方杰, 刘成华, 高亚萍, 沈倍奋, 杨光. 抗铜绿假单胞菌PcrV蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证[J]. 中国免疫学杂志, 2018, 34(2): 233-238. [DOI]
|
| [51] |
Le S, Yao X, Lu S, Tan Y, Rao X, Li M, Jin X, Wang J, Zhao Y, Wu NC, Lux R, He X, Shi W, Hu F. Chromosomal DNA deletion confers phage resistance to Pseudomonas aeruginosa[J]. Sci V Rep, 2014, 4: 4738.
[DOI]
|
| [52] |
Jakobsen TH, Bjarnsholt T, Jensen PØ, Givskov M, Høiby N. Targeting quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilms: current and emerging inhibitors[J]. Future Microbiol, 2013, 8(7): 901-921.
[DOI]
|