2022, Vol. 17
2. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京 102206
2. National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Center for Disease Control and Prevention of China, Beijing 102206, China
朊病毒(Prion)是一种不含有核酸、具有自我复制能力的感染性蛋白粒子。目前已知的人类朊病毒病主要有4种，分别为克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔综合征(Gerstmann Staussler Scheinker syndrome，GSS综合征)、库鲁病和致死性家族性失眠症，其中以CJD最为常见[1-2]。CJD的潜伏期通常为1.5~10年，其典型的临床表现为进行性发展的痴呆，肌痉挛，小脑共济失调，运动性失语，并迅速发展为半瘫、癫痫甚至昏迷，患者最终死于感染或中枢神经系统衰竭[2]。
根据发病原因，可将CJD分为散发型CJD(sporadic CJD, sCJD)、遗传型CJD(genetic CJD, gCJD)、医源型CJD(iatrogenic CJD, iCJD)和变异型CJD(variant CJD vCJD) 4种[3-4]。sCJD病理发病原因尚不明确，约占CJD患者总数的85%[5]。gCJD则主要由患者体内编码蛋白感染粒(proteinaceous infectious particle，PrP)蛋白的基因PRNP发生突变所导致，约占CJD患者总数的8.6%。iCJD和vCJD均属于获得性CJD，该类患者所占比例较小，目前国内尚缺乏相关报道。iCJD患者主要因使用被CJD污染未消毒彻底的医疗手术器械或者接受CJD患者的角膜移植等原因而获得感染。vCJD则主要是由食用了被疯牛病污染的牛肉制品所导致，另外，也有实验人员在处理经朊病毒感染后的实验动物组织的过程中，因发生意外暴露而导致感染vCJD[6]。
CJD患者的脑组织具有极高的感染性，其角膜、脑垂体提取物、硬脑膜以及使用过的神经外科器械都有医源性感染的危险[7-10]。朊病毒对于常规的消杀方法具有较强的抵抗能力，须满足专门的消杀条件才能将其灭活。根据中国疾病预防控制中心的建议，在临床上，滴洒或污染有病人血液或其他组织的物品可用20 000 μg/g的NaClO，或有效氯浓度为20 g/L的巴氏消毒液, 或2 mol/L的NaOH表面覆盖浸泡1~2 h进行消杀；接触患者组织且重复使用的非一次性器械则须经134~136 ℃高压蒸汽灭活至少1 h；接触患者组织的一次性锐器可放入适当的容器焚烧处理；死亡患者的遗体须焚烧处理, 其衣服被褥等如污染有血液也应进行焚烧处理。
目前，世界范围内尚无可有效治疗CJD的药物与方法，因此，尽早对疑似患者进行临床检查与实验室检测，并根据诊断结果做出相应的防护措施，对于疾病的防控具有重要意义[11]。
1 PrPSc的直接检测细胞朊粒蛋白(cellular prion protein，PrPC)由PRNP基因编码，可在人体内正常表达，当其发生错误折叠，就会形成病理性的羊瘙痒病朊粒蛋白(scrapie prion protein，PrPSc)，即朊病毒。新生成的PrPSc会继续诱导更多PrPc发生构象转化，并在大脑内发生异常聚集，损伤神经元，从而导致疾病的发生[12]。
患者脑组织样本内PrPSc的直接检出是世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的确诊朊病毒疾病的金标准[13]。通常使用免疫组化或免疫印迹技术来检测PrPSc。PrPSc蛋白对蛋白酶K具有抵抗力，因此，在将脑组织样本经蛋白酶K处理后，通过免疫组化技术或免疫印迹技术仍能检测到的PrP蛋白则被认为是PrPSc。除了患者的脑组织，有研究在vCJD患者的淋巴网状组织中直接检测出PrPSc，但在其他类型的CJD患者淋巴网状组织中则未能检测得到[14-16]。然而患者的脑组织样本较难获得，使得病理检测方法在实际应用中使用频率较低。相比之下，其他实验室检测方法具有更高的可行性。
2 PrPSc的扩增后检测除脑组织外，CJD患者其他组织或者体液样本内也可能存在PrPSc，但是由于蛋白丰度较低，无法通过常规病理检测直接检出。因此，利用PrPSc可以在一定条件下发生复制的特点，将样本内PrPSc经体外扩增后再进行检测成为PrPSc检测技术的一种发展趋势。目前，该类技术主要包括连续蛋白质错误折叠循环扩增技术(protein misfolding cyclic amplification，PMCA)和实时震动诱导转化技术(real-time quaking-induced conversion，RT-QuIC)[17]。
2.1 PMCA技术PMCA技术利用PrPSc能够诱导PrPc种子发生错误折叠的基本原理，将待测样本与含有正常PrPc的组织匀浆混合后，通过孵育-超声的循环过程使更多的PrPc底物转化为PrPSc，从而实现对样本中PrPSc的扩增，扩增产物内的PrPSc含量得到了提高，则可通过常规的免疫印迹法进行检测。与常规方法相比，PMCA技术大大提高了对PrPSc的检测灵敏度，可用于PrPSc含量较低的患者样本的检测[18]。此外，由于经PMCA扩增得到的朊病毒仍具有一定的感染性，其扩增产物则可用于后续的动物实验，该项技术一方面为CJD的相关基础研究提供了方便，另一方面其使得对生物安全防护的要求更为严格。
2.2 RT-QuIC技术RT-QuIC的基本原理与PMCA技术相似，PrPSc能够诱导PrPc发生错误折叠，形成纤维化产物，纤维化产物在震荡条件下碎裂生成的中间产物可以进一步诱导PrPc错误折叠，最终实现对PrPSc的扩增。在该扩增过程中，纤维化产物能够与硫黄素T (ThT)结合发出荧光，通过实时采集荧光信号即可辨别出阳性样本。目前，来自全球不同的研究团队已使用该方法分别从患者的脑脊液、尿液、鼻拭子以及皮肤样本中成功检测出PrPSc[19-22]。与PMCA相比，RT-QuIC的检测通量更高，可检测样本的范围更广，并且可以实现对扩增过程中体系内荧光信号的实时监测。相较于传统检测方法，RT-QuIC技术也提高了检测的灵敏度和特异性，并且获取所需样本的难度也相对降低，该技术在CJD的实验室检测中具有较高的发展潜力。事实上，美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)已于2018年将RT-QuIC检测纳入朊病毒病的诊断标准[23]。
3 疾病标志物检测前文提到的2种对PrPSc的扩增检测对专用扩增仪器依赖度较高：PMCA技术须先使用具备孵育-超声连续循环功能的蛋白质错误折叠循环扩增仪对样本进行扩增，之后再使用常规免疫印迹试验(Western blot)或酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术进行检测；RT-QuIC检测则须使用具备温控、高频振动和动力学检测功能的酶标仪来实现样本的扩增与实时荧光检测，目前国际上用于RT-QuIC检测的主流仪器为德国BMG LABTECH公司的Omega系列酶标仪。由于PMCA与RT-QuIC技术所需的扩增仪器目前在国内普及率较低，相比之下，使用常规方法对患者样本内的疾病标志物进行检测更容易实现，下文主要介绍CJD患者脑脊液内的几种常见疾病标志物。
3.1 14-3-3蛋白生理状态下14-3-3蛋白参与调节细胞分化、信号转导以及神经传递等多种生物功能，当神经元受到损伤时，细胞内的14-3-3蛋白会释放到脑脊液中。在朊病毒病患者脑脊液内，14-3-3蛋白的含量明显升高。大量研究证实，通过检测脑脊液内的14-3-3蛋白来诊断CJD的灵敏度约为90%~97%，特异度约为87%~100%[11, 24]。在1996年，脑脊液内14-3-3蛋白的检测被WHO纳入了散发性CJD的诊断标准。目前，主要通过免疫印迹法来检测患者脑脊液样本中的14-3-3蛋白，羊脑组织匀浆可以在该检测中作为阳性对照[24-25]。
3.2 tau蛋白与14-3-3蛋白类似，脑脊液内总的tau蛋白(T-tau)水平与神经元的损伤密切相关。T-tau主要包括磷酸化tau蛋白(P-tau)和内非磷酸化tau蛋白(non-p-tau)。在CJD患者的脑脊液中，T-tau水平以及T-tau与P-tau的比值远高于其他疾病，以此为依据对CJD进行鉴别，具有较高的灵敏度(92.3%)和准确率(97%)[26]。还有研究显示，CJD患者脑脊液内non-p-tau水平明显升高，且通过non-p-tau检测鉴定CJD的准确率和灵敏度分别高达94.39%和94.44%，均高于14-3-3蛋白(92.92%，88.89%)[27]。尽管WHO目前推荐的CJD脑脊液实验室检测标记物仍以内14-3-3蛋白为主[2]，越来越多的研究证明tau蛋白具备成为CJD疾病标记物的潜能。
3.3 其他标志物除了14-3-3蛋白与tau蛋白之外，研究人员也在积极寻找其他潜在的CJD疾病标志物。神经纤维丝轻链蛋白(neurofilament light chain，Nfl) 是神经轴突的主要细胞骨架蛋白，当发生神经损伤时，Nfl会被释放到细胞外。有研究表明，sCJD患者脑脊液内的Nfl水平会显著升高，尤其是在一些疾病进程较慢的患者体内，当14-3-3蛋白与tau蛋白含量尚不足以被检出时，就可以检测到Nfl水平显著升高[28]。有研究证实，在鉴别CJD与非痴呆对照组时，T-tau具备更高的灵敏度，而在鉴别CJD与其他非CJD性痴呆时，Nfl的灵敏度高于T-tau[29]。另外，在鉴别CJD与快速进展的阿尔兹海默症和慢速进展的阿尔兹海默症时，Nfl表现出比T-tau更高的准确性[29]。而与Nfl相比，T-tau的分子水平则与疾病进程的关系更为密切，在对患者的生存预测分析中更具潜力[29]。这些研究提示，在不同的应用场景下，将不同标志物的检测结果结合分析，将更有利于CJD的鉴别诊断。
除Nfl以外，科研人员还发现了多种具有协助CJD诊断潜力的蛋白分子。例如：有研究发现α-突触核蛋白(α-synuclein)的水平在CJD患者的脑脊液中显著升高，且在鉴别sCJD时具有高达94%的灵敏度和96%的特异性[30]；而且，钙结合蛋白(S100b)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)以及神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE) 等在CJD患者脑脊液中的表达水平也均高于对照组患者[31-32]。由于目前针对这些蛋白分子的研究还不够充分，它们在CJD诊断中的特异性与灵敏度仍有待被进一步验证[33]。
4 PRNP基因的检测PRNP基因负责编码PrP蛋白。生理状态下，PrP蛋白参与细胞黏附、神经突出形成、昼夜节律等多种生物过程。当PNRP基因发生突变时，其所编码的PrP蛋白异常折叠，形成具有毒性的蛋白异构体PrPSc并累积于神经元内，最终导致CJD的发生[2]。由PRNP基因突变所引起的CJD被称为遗传型CJD，约占CJD总数的5%~15%[3]。目前，PRNP基因上已经有30多个突变位点被鉴定出与遗传型CJD有关，且这些突变位点在不同种族的患者之中也呈现出不同的分布特点: 在欧洲，200位点的突变所占比例最高，其次为210和178位点，而在亚洲，180位点突变所占比例最高，210位点突变则相对罕见[4]，在我国，T188K突变在gCJD病例中所占比例最高，约为32%[3]。此外，有研究证实，散发性CJD的发病趋势还与患者PRNP等位基因多态性有关，CJD易感性从高到低依次为：129甲硫氨酸纯合子(M/M)>129甲硫氨酸/缬氨酸杂合子(M/V)>129缬氨酸纯合子(V/V)[34-35]。而我国汉族人群中PRNP等位基因在129位点为M/M纯合子的比例高达98%，提示汉族人群为散发性CJD易感人群[34]。PRNP基因测序分析作为一种常规实验室检测方案，对于分析鉴别遗传型CJD具有重要的参考价值。
5 结语根据WHO的推荐，CJD的临床诊断须依据患者的临床表现与实验室检查结果来综合判断。基于CJD的诊断标准，并依据患者临床上是否出现快速进展性痴呆，同时伴随肌阵挛、视觉或者小脑症状、椎体束/锥体外体系症状、无动性缄默，以及脑电图显示EEG周期性尖慢复合波、脑脊液14-3-3蛋白阳性且病程少于2年等症状，将患者划分为很可能CJD与可能CJD。我国从2006年起正式在全国范围内设置监测位点进行CJD的监测。目前，针对CJD疑似患者样本的常规检测，主要包括患者脑脊液样本内14-3-3蛋白的Western blot检测与血液样本中PRNP基因的测序与分析。由于14-3-3蛋白为非特异性指标，在临床诊断中主要起到辅助判断的作用，而CJD的最终确诊仍须以PrPSc的检出为金标准。因此，针对患者组织体液样本内微量PrPSc的扩增检测技术包括RT-QuIC与PMCA，势必将成为CJD实验室检测领域的主要发展趋势。
值得注意的是，截至目前国际上已有多例关于实验室工作人员意外感染朊病毒的报道[6]。由于感染后致死率为100%，因此在发展与推广朊病毒检测技术的同时，应格外关注朊病毒实验室检测工作的生物安全问题。首先，从事朊病毒检测与科研工作的技术人员须通过专业的相关生物安全培训与考核；其次，朊病毒专用实验室须具备完善的朊病毒消杀条件、独立的废弃物处理系统和全面的突发事件应急机制；最后，有关部门还须加强对朊病毒实验室活动的监督管理工作，以确保将实验室意外感染的风险降到最低。
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