2023, Vol. 18
2. 南部战区疾病预防控制中心，广东 广州 510507
2. Center for Disease Control and Prevention of Southern Theater Command of PLA, Guangzhou 510507, Guangdong Province, China
蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)又称森林脑炎病毒，属于黄病毒科黄病毒属成员[1]，是蜱传脑炎的病原体。中国流行的TBEV属于远东亚型，该亚型致病性较强，死亡率可达40%以上[2-4]。目前针对TBEV感染尚无有效的抗病毒药物。合适的感染动物模型是抗TBEV药物研发和疫苗评估的有力工具[5]。
TBEV可感染多种动物，如田鼠、金黄地鼠、昆明小鼠、C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠。Filipi等[6]证实：田鼠可作为TBEV的传播宿主，并从田鼠体内分离到TBEV欧洲亚型毒株。刘双军等[7]通过颅内注射、肌肉注射、腹腔注射、灌胃、滴鼻等多种途径令昆明小鼠感染TBEV，并分析比较了各种攻毒途径对病毒感染性的影响。有研究在C57BL/6小鼠中，比较了TBEV Torö-2003和HB171/11毒株对小鼠中枢神经系统的侵袭性和毒性差异[8]。BALB/c小鼠曾被用于评估葡聚糖固化重组蛋白对TBEV感染小鼠的保护作用[9]。金黄地鼠和田鼠个体较大、难操作，而小鼠个体小、易操作、遗传背景明确，且其对多种病原体的敏感性也较高，因此小鼠在建立感染动物模型中最常用，其中BALB/c小鼠被广泛用于病毒学和免疫学方面的研究[10]。
本研究选择6周龄雌性BALB/c小鼠作为实验动物。鉴于TBEV主要通过蜱叮咬传播，皮下注射可更好地模拟自然感染，因此采用皮下注射途径攻毒。攻毒后观察2种攻毒剂量对小鼠感染症状、体重变化及生存率的影响，并检测小鼠脑、脾、肾组织中TBEV抗原表达、组织的病理改变和病毒滴度，检测组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA、干扰素β(interferon β，IFN-β)mRNA表达水平的动态变化。本研究成功建立TBEV感染的BALB/c小鼠模型。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒、抗体与细胞TBEV由海军军医大学生物医学防护教研室保存。TBEV免疫小鼠腹水由本研究室保存。非洲绿猴肾细胞Vero由本研究室保存。猪肾细胞PK-15由复旦大学基础医学院病原生物学系叶荣研究员馈赠。TBEV用Vero细胞扩增，收集病毒，在PK-15细胞上用空斑实验测定滴度，以病毒空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)表示，病毒分装后贮存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 实验小鼠无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级6周龄雌性BALB/c小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，体重为15~17 g。动物饲养与实验操作在海军军医大学生物安全3级实验室内开展。实验设计符合海军军医大学实验动物的伦理要求。
1.1.3 主要试剂胎牛血清、DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基、青霉素和链霉素双抗、谷氨酰胺、0.5%胰酶-乙二胺四乙酸、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自美国Gibco公司。柠檬酸抗原修复液、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、二氨基联苯胺显色液、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染液购自武汉塞维尔生物技术有限公司。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自美国Affymetrix公司。TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。质量分数为3%的过氧化氢溶液购自国药集团化学试剂有限公司。质量分数为4%的多聚甲醛购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。结晶紫购自美国Genview公司。羧甲基纤维素钠购自美国Sigma-Aldrich公司。M-MLV反转录酶、dNTP Mix、Eastep qPCR Master Mix购自美国Promega公司。随机引物和引物在北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 实验小鼠分组与攻毒BALB/c小鼠用电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)称量体重，根据体重随机分为Mock组(未感染病毒的对照小鼠)、103 PFU和104 PFU的TBEV感染组，共3组，每组有5只小鼠。病毒感染组每只小鼠经颈后部分别皮下注射103 PFU或104 PFU的TBEV(DMEM培养基稀释)，100 μL/只，Mock组每只小鼠注射等体积的DMEM培养基。注射当天记为第0天，攻毒后每日观察小鼠感染症状、称量小鼠体重并记录死亡小鼠数量。
1.2.2 小鼠脑、脾、肾组织样品收集BALB/c小鼠经颈后部皮下注射途径感染TBEV，103 PFU/只。感染后第5、7、9天，在生物安全柜内(美国Thermo Fisher Scientific公司)处死小鼠，解剖后分别取小鼠的脑、脾、肾组织。采集的脑、脾、肾组织用PBS洗涤，分别加入PBS(检测病毒滴度)、TRIzol(检测IFN-β与TNF-α mRNA水平)，在冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司)上研磨，条件为-25 ℃、65 Hz、80 s。研磨样品用低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)离心，4 ℃、10 000 r/min离心10 min后收集上清液，进行相应检测。采集脑、脾、肾组织，经质量分数为4%的多聚甲醛固定24 h后进行免疫组织化学和HE染色分析。
1.2.3 免疫组织化学组织石蜡切片脱蜡，置于柠檬酸抗原修复缓冲液进行抗原修复。切片冷却，用PBS洗涤3次，放入3%过氧化氢溶液于室温避光孵育25 min。PBS洗涤3次，加入3% BSA封闭30 min，切片上滴加TBEV免疫小鼠腹水(1∶500)，切片于湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(1∶1 000)，室温孵育50 min。PBS洗涤3次，加入二氨基联苯胺显色液，在显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素染液复染3 min后水洗，分化液分化数秒后水洗，返蓝液返蓝后水洗。脱水封片，采用成像系统Nikon DS-U3(日本尼康)采集图像并分析。
1.2.4 HE染色组织石蜡切片脱蜡，放入苏木素染液染色5 min，水洗，用分化液分化，水洗，返蓝液返蓝，再水洗。切片放入体积分数为85%、95%的酒精梯度脱水各5 min。放入HE染液染色5 min。脱水封片，采用成像系统Nikon DS-U3采集图像并分析。
1.2.5 空斑实验将PK-15细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)内，培养基为含体积分数10%的胎牛血清、质量分数1%的谷氨酰胺、质量分数1%的青霉素链霉素的DMEM。用胰酶-乙二胺四乙酸消化细胞，接种于12孔培养板，培养至细胞密度约100%。收集的小鼠脑、脾、肾组织研磨样品以10倍系列稀释后加至细胞，每个稀释度设3个重复孔。TBEV在PK-15细胞上的空斑实验参照文献[11]并做修改，以质量分数2%的羧甲基纤维素钠作为覆盖液，质量分数1%的结晶紫染色，质量分数4%的多聚甲醛固定。
1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)收集小鼠脑、脾、肾组织研磨样品进行RNA抽提，使用多功能酶标仪(美国BioTek公司)检测RNA的纯度和浓度，加入随机引物、M-MLV反转录酶和dNTP Mix反转录成cDNA。使用Eastep qPCR Master Mix，在Rotor-Gene 3000 PCR仪(澳大利亚Corbett公司)上进行扩增。扩增条件如下：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s，共40个循环。采用Rotor-Gene 6.1.81软件、ΔΔCt法对目的基因进行相对定量分析，GAPDH作为内参。
鼠源引物序列如下。GAPDH：正向5′-TGCCCAGAACATCATCCCTG-3′，反向5′-ATCCACGACGGACACATTGG-3′。IFN-β：正向5′-CGGACTTCAAGATCCCTATGGA-3′，反向5′-TGGCAAAGGCAGTGTAACTCTTC-3′。TNF-α：正向5′-CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3′，反向5′-TTGAGATCCATGCCGTTG-3′。
1.2.7 统计学分析与作图采用Graphpad Prism 8.0软件对实验数据进行统计学分析，数据以平均值±标准差(Mean ±SD)表示。采用t检验进行组间差异性比较，生存率数据采用Log rank检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 TBEV感染BALB/c小鼠的体重及生存率显著下降TBEV通过皮下注射途径感染BALB/c小鼠，采用103 PFU/只和104 PFU/只2种攻毒剂量，之后连续12天，每天观察小鼠的感染症状，称量体重。攻毒后第8天，103 PFU、104 PFU感染组小鼠均开始出现弓背、后肢瘫痪的症状，并逐日加重，而未感染病毒的Mock组小鼠无此症状。如图 1A所示，在观察时段内，Mock组小鼠的体重呈上升趋势。与Mock组小鼠的体重相比，103 PFU组小鼠在攻毒后第1、2、9天体重显著下降(P < 0.01、P < 0.05)，之后体重逐渐回升，至第12天小鼠体重接近Mock组小鼠体重；104 PFU组小鼠在攻毒后第1、7、8、9、10天体重显著下降(P < 0.05)，之后体重持续下降。同时发现，103 PFU组小鼠在感染后第9天死亡2只，第11天死亡1只；104 PFU组小鼠在感染后第8天死亡1只，第12天共死亡4只(见图 1B)。第21天，103 PFU组存活2只、104 PFU组存活1只。与Mock组小鼠的生存率相比，103 PFU、104 PFU组小鼠生存率均降低，差异具有显著性(P < 0.05)。结果表明，TBEV在BALB/c小鼠体内建立感染，攻毒剂量104 PFU的致死率高于103 PFU的致死率。下述TBEV在BALB/c小鼠体内感染特性的研究采用皮下注射103 PFU/只的攻毒方式，并动态收集鼠脑、脾、肾组织标本，进行相应检测。
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| A: Changes in body weight of mice. B: Survival curve of mice. BALB/c mice were subcutaneously inoculated with 103 PFU and 104 PFU of TBEV. Data were expressed as the mean±SD of two experiments (n=5). Body weight data were analyzed by unpaired t test and survival data were analyzed by Log rank test. Mock: without TBEV inoculation. *: P < 0.05;**: P < 0.01. *(Red): 103 PFU TBEV vs mock; *(Blue): 104 PFU TBEV vs mock. 图 1 TBEV感染BALB/c小鼠的体重及生存率变化 Fig. 1 Changes in body weight and survival rate of BALB/c mice infected with TBEV |
采用免疫组织化学检测TBEV感染小鼠脑、脾、肾组织中病毒抗原的表达。如图 2所示，Mock组的脑、脾、肾组织均未检测到TBEV抗原。攻毒后第5天，在脾组织中可检测到TBEV抗原(棕黄色为阳性信号)。第7天，脑、肾组织中也检测到TBEV抗原的表达。第9天，TBEV抗原在脑、脾、肾组织中的表达均增多，阳性信号较第5、第7天增强。第7天，仅在大脑皮质、丘脑部位检测到TBEV抗原且阳性信号较弱；第9天，在大脑皮质、海马体、丘脑、下丘脑等部位均可检测到TBEV抗原且阳性信号较强。以上结果显示，随着感染时间的延长，脑组织中TBEV抗原的表达明显比脾、肾组织的抗原表达强。
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| BALB/c mice were infected with TBEV by subcutaneous injection. Detection of TBEV antigen in brain, spleen and kidney of the mice on day 5, 7 and 9 post-infection by immunohistochemistry, respectively. TBEV antigen in brain, spleen and kidney of mock mice was detected on day 9. The representative images of two independent experiments were shown. Original magnification: ×400. Mock: without TBEV infection. 图 2 TBEV感染BALB/c小鼠脑、脾、肾中TBEV抗原的分布 Fig. 2 Distribution of TBEV antigen in brain, spleen and kidney of TBEV-infected BALB/c mice |
除检测TBEV抗原在感染BALB/c小鼠的脑、脾、肾组织的分布外，还观察了组织的病理变化。对TBEV感染小鼠脑、脾、肾组织行HE染色，仅发现脑组织出现轻微的病理改变。脑组织病理切片结果显示，感染后第5天，鼠脑组织开始出现神经元固缩，细胞周围间隙增大(见图 3黑色箭头处)，第7天、第9天，鼠脑组织病理学改变仍同第5天，病理学改变不明显(见图 3)。在感染后第9天，丘脑部可见少量的炎症细胞浸润(结果未示)。
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| BALB/c mice were infected with TBEV by subcutaneous injection. HE staining of brain sections of mice on day 5, 7 and 9 post-infection, respectively. HE staining of brain sections of mock mice on day 9. The gaps around the cells became larger (Black arrows). The representative images of two independent experiments were shown. Original magnification: ×200. Mock: without TBEV infection. 图 3 TBEV感染BALB/c小鼠脑组织的病理改变 Fig. 3 Pathological changes in brain of TBEV-infected BALB/c mice |
采用空斑实验进一步检测攻毒后鼠脑、脾、肾组织中的病毒滴度。在小鼠感染后第5天，仅脾内可检测到TBEV且病毒滴度仅为15 PFU/mL(见图 4)。在第7天，脑、肾组织中也检测到TBEV且脑组织中病毒滴度高达3.67×106 PFU/mL，而肾组织中病毒滴度只有20 PFU/mL。至第9天，脑、脾、肾组织中的病毒滴度均升高，其中脑中病毒滴度最高，为1.33×107 PFU/mL。与第7天的脑、脾组织中病毒滴度相比，第9天的脑、脾组织中病毒滴度显著升高(P < 0.05)。此外，脑、脾、肾组织中病毒滴度的检测结果与TBEV抗原在3种组织中的分布一致。结果提示，TBEV感染后，病毒首先在鼠脾内复制增殖，之后在脑、肾中增殖，随着TBEV感染时间的延长，TBEV最终在脑中大量增殖。
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| BALB/c mice were infected with TBEV by subcutaneous injection. Brain, spleen and kidney were collected on day 5, 7 and 9 post-infection, respectively. TBEV titers in brain, spleen and kidney of the mice were determined by plaque assay. Data were expressed as mean±SD of three experiments (n=3). Data were analyzed by unpaired t test. *: P < 0.05. UD: undetectable. 图 4 TBEV感染BALB/c小鼠脑、脾、肾中TBEV滴度 Fig. 4 TBEV titers in brain, spleen and kidney of TBEV-infected BALB/c mice |
本研究不仅检测TBEV在BALB/c小鼠体内的复制增殖，还研究了小鼠针对TBEV感染产生的免疫应答。利用实时荧光定量PCR监测TBEV感染BALB/c小鼠脑、脾、肾组织中TNF-α与IFN-β mRNA水平的动态变化，并与Mock组小鼠脑、脾、肾组织中相应因子mRNA水平进行比较。结果如图 5A所示，TBEV感染小鼠后第5天(P < 0.05)、第7天(P < 0.001)、第9天(P < 0.05)其脾内TNF-α mRNA的表达受到了显著抑制；TBEV在感染后第7天其脾内IFN-β mRNA的表达增强(P < 0.05)，而在第5天(P < 0.01)、第9天(P < 0.05)脾内IFN-β mRNA的表达受到抑制。在BALB/c小鼠肾组织，TBEV感染后第7天(P < 0.01)、第9天(P < 0.001)TNF-α mRNA的表达受到抑制；在感染后第9天IFN-β mRNA的表达被显著抑制(P < 0.001，见图 5B)。在TBEV感染后第9天，脑组织中TNF-α mRNA水平显著降低(P < 0.05)；TBEV感染小鼠脑组织中IFN-β mRNA水平无明显变化，第9天时表达略微升高(见图 5C)。上述结果揭示了TBEV感染小鼠后其脑、脾、肾组织中TNF-α与IFN-β mRNA表达水平的动态变化。
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| Levels of TNF-α and IFN-β mRNA in spleen (A), kidney (B) and brain (C) of TBEV-infected BALB/c mice were detected by quantitative real time-PCR. Data were shown as fold of the mRNA levels in brain, spleen and kidney of mice on day 5, 7 and 9 post-infection over the corresponding mRNA levels of mock. Data were expressed as mean±SD of three experiments (n=3). Data were analyzed by paired t test. *: P < 0.05;**: P < 0.01;***: P < 0.001;P: compared to the mock. Mock: without TBEV infection. 图 5 TBEV感染BALB/c小鼠脑、脾、肾中TNF-α、IFN-β mRNA的表达 Fig. 5 Expression of TNF-α and IFN-β mRNA in brain, spleen and kidney of TBEV-infected BALB/c mice |
TBEV借助媒介、宿主和环境之间的相互作用传播病毒，对人类健康造成严重威胁[12]。TBEV经蜱传播，主要分布在北温带与寒带地区[13]。目前，尚无针对TBEV感染的有效抗病毒药物，抗病毒药物的研发需要合适的动物模型进行体内抗病毒作用的评估。BALB/c小鼠具有对病毒敏感性较高，以及遗传背景明确，个体小，易操作的优点，常被用作感染动物模型的实验动物[14]。因此，本研究选用BALB/c小鼠作为TBEV感染的实验动物。为更好地模拟病毒自然感染，采用103 PFU和104 PFU 2种攻毒剂量经皮下注射途径感染小鼠，发现2种剂量均可导致小鼠出现弓背、后肢瘫痪的症状，这与Chernokhaeva等[15]研究中观察到TBEV的感染症状一致。Petry等[16]通过皮下注射途径感染C57BL/6小鼠，也出现弓背、竖毛、后肢瘫痪等感染症状。此外，攻毒后BALB/c小鼠的体重及生存率均显著下降。随着感染时间的延长，103 PFU组小鼠的体重逐渐回升而104 PFU组小鼠体重持续下降，并且103 PFU组小鼠的存活率较104 PFU组小鼠更高。结果表明，TBEV通过皮下注射途径攻毒可以在BALB/c小鼠体内建立感染，攻毒剂量104 PFU的致死率高于103 PFU。基于TBEV自然感染的致病性与死亡率，本研究选用103 PFU /只的攻毒方式感染小鼠。
除观察小鼠的感染症状、体重、存活率等整体指标，本研究还进一步揭示小鼠各组织中TBEV抗原分布、组织病理改变和病毒滴度的动态变化，更全面地解析了病毒在小鼠体内复制增殖的特性。免疫组织化学与HE染色结果显示，脾、肾组织中可检测到TBEV抗原，但未发现明显的病理改变；脑组织中TBEV抗原的表达高于脾、肾组织，且感染后第5天出现病理改变；TBEV在各组织中的增殖水平与感染时间呈正相关。空斑实验表明，感染后首先在脾组织中检测到极低滴度的TBEV，之后在脑、肾组织中均检测到病毒，脑组织中TBEV滴度最高，脾组织内滴度次之。以上结果表明，TBEV感染后首先在脾中进行复制增殖，随后扩散至肾与脑，在脑中大量增殖并导致病理改变。虽然脾内首先检测到病毒(抗原及滴度)且滴度较高，但并未出现病理改变，提示脑而非脾是TBEV感染的靶器官。本研究为TBEV的嗜神经性提供了可靠的实验数据。
TNF-α、白细胞介素6等是重要的促炎细胞因子，这些炎症因子在生物损伤、病毒感染和组织病理改变过程中起重要作用[17-18]。I型干扰素(IFN-α/β)的产生是机体抵抗病毒入侵的重要防线。据报道，TBEV感染可延迟诱生IFN-α/β[19]。本研究检测了TNF-α、IFN-β的mRNA表达水平以评估BALB/c小鼠针对TBEV感染产生的免疫应答。与未感染病毒的对照组小鼠比较，TBEV感染小鼠的脑、脾、肾组织中TNF-α mRNA表达水平均显著下降，提示在感染早期，病毒于宿主体内增殖从而抑制宿主的炎症防御反应。TBEV感染对脑组织的IFN-β mRNA水平无明显影响，但降低了肾组织的IFN-β mRNA水平。TBEV感染后第7天，脾组织IFN-β mRNA的表达水平提高，之后其表达受到抑制。以上结果表明，TBEV感染对不同组织IFN-β mRNA表达的调控呈动态变化趋势，此可能与病毒的复制、增殖有关。
综上所述，本研究采用皮下注射TBEV途径攻毒，观察小鼠感染症状、体重及生存率，检测鼠脑、脾、肾组织中TBEV抗原表达、组织病理改变、病毒滴度和相关细胞因子mRNA表达水平的动态变化。对多项指标的综合分析表明，TBEV在BALB/c小鼠体内建立感染，为后续开展抗TBEV药物筛选研究提供了合适的感染动物模型。
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