病原菌感染是引起耳部化脓性感染最重要的因素之一。其中，细菌是最主要的病原体^[1]，但真菌引起的耳部感染越来越受到重视^[2]。儿童为特殊人群，抗感染可选用的抗生素或抗真菌药物种类有限，须考虑药物毒副作用对儿童身心健康发展的影响。而病原菌的分离培养往往耗费数日，临床医生在拿到培养结果及药敏报告前可能会经验性抗菌治疗，所以了解相应地区儿童耳炎病原菌的分布特征及药敏试验情况显得尤为重要。目前，国内对儿童耳炎病原菌的分布及耐药性分析研究相对较少，而南宁地区更是缺乏相应的报道。本研究回顾性分析了广西壮族自治区妇幼保健院2019—2021年儿童耳炎病原菌种类分布特征及主要病原菌的耐药情况，旨在为本地区临床医生合理用药从而经验性治疗儿童耳炎提供病原学参考依据。

1 对象与方法 1.1 研究对象

本研究为回顾性统计分析，纳入2019年1月—2021年12月广西壮族自治区妇幼保健院0~14岁儿童耳分泌物培养阳性患者。样本纳入标准：①14岁以下儿童(包括14岁)；②有外耳道炎或中耳炎症状；③送检耳分泌物进行细菌和真菌培养并分离出病原菌。排除标准：剔除同一患者3个月以内重复送检的标本，保留第1次耳分泌物培养阳性标本进行分析。

1.2 研究材料

① 统计分析送检耳分泌物儿童的性别差异、培养阳性率、不同年龄段儿童(新生儿：≤28 d；婴儿：> 28 d且≤ 1岁；1~5岁儿童；6~14岁儿童)耳分泌物培养结果阳性的构成比，以及各年龄段内病原体类型的构成比，并比较构成比的差异是否有统计学意义。②按革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌或混合感染，分类统计各种病原菌检出的构成比；③统计分析所检出的主要革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和念珠菌的耐药情况。

1.3 培养及药敏试验

采用75%酒精清洁患儿耳廓及外耳道后，使用湿润的无菌拭子采集脓性耳分泌物，于2 h内室温送至微生物实验室进行需氧培养。培养的同时接种哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板和沙保罗琼脂平板(迪景，珠海)，于含体积分数5%的CO₂、37 ℃培养箱内培养18~24 h。并将原始标本涂片，革兰氏染色后镜检，观察白细胞数量及病原菌。

将病原菌分纯培养18~24 h后用DL-96全自动微生物鉴定及药敏分析仪(珠海迪尔生物工程股份有限公司)进行鉴定及药敏试验。细菌药敏试验折点参考美国临床与实验室标准协会指南(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)第30版^[3]，念珠菌药敏试验折点参考CLSI M27标准^[4]。

1.4 统计分析

使用Statistical Product and Service Solutions (SPSS) 25.0版软件进行统计分析。阳性率及构成比的比较使用卡方检验或Fisher确切概率法进行分析。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

共送检918份耳分泌物样本，其中男性554例，女性364例。培养检出细菌和/或真菌的样本共623例(67.86%)，培养结果为阴性的有295例(32.14%)。阳性样本中，仅检出细菌的有438例(70.30%)，仅检出真菌的有164例(26.32%)，细菌合并真菌为21例(3.37%)。

2.1 患者基本情况分析

623例阳性样本中，男孩为374例，阳性率为67.51%，女孩为249例，阳性率为68.41%，不同性别阳性率差异无统计学意义(P=0.776)。

不同的年龄段中，婴儿阳性构成比最高，占46.23%。多组比较分析发现，不同年龄段的阳性构成比差异具有统计学意义(P=0.033)；经两两比较分析可知，婴儿组与学龄前儿童组、婴儿组与6~14岁儿童组病原菌构成比差异具有临床意义，均P＜0.05。除了新生儿组，其余3组检出的病原菌里，仅检出细菌的构成比最高，组内构成比均大于60%，且差异具有统计学差异。儿童患者的基本情况如表 1所示。

2.2 儿童耳炎病原菌分布

438例检出细菌的病例中，检出单一细菌403例(92.01%)，其中金黄色葡萄球菌最多(202例，50.12%)，其次为肺炎链球菌(87例，21.59%)。同时，检出2种细菌的有35例(7.63%)，以金黄色葡萄球菌合并卡他莫拉菌居多(7例，20.00%)。另外，细菌合并真菌阳性有21例，最终共分离出细菌491株。

491株细菌中革兰氏阳性菌居多，共339株，构成比为69.04%。在革兰氏阳性菌中排名前3位的分别是金黄色葡萄球菌(222株，45.21%)、肺炎链球菌(89株，18.13%)、化脓链球菌(17株，3.46%)。共分离革兰氏阴性菌152株(30.96%)，排名前两位的分别是铜绿假单胞菌(75株，15.27%)、流感嗜血杆菌(26株，5.30%)，而鲍曼不动杆菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌均检出10株(2.04%)。具体数据如表 2所示。

另外，有164例标本检出真菌，其中135例(82.32%)仅检出一种真菌，而同时检出2种真菌的有29例(17.68%)。在检出2种真菌的病例中，念珠菌合并曲霉的有26例(89.67%)，检出2种念珠菌的为1例(3.45%)，同时检出2种曲霉的为1例(3.45%)，赛多孢属合并帚霉属的有1例(3.45%)。加上细菌合并真菌阳性的21例，最后共分离出真菌214株，其中念珠菌103株(48.13%)，丝状真菌111株(51.87%)。念珠菌检出数排名前2位的分别为近平滑念珠菌(55株，25.70%)和白念珠菌(38株，17.76%)。丝状真菌包括曲霉109株(50.93%)，赛多孢属1株(0.47%)，帚霉属1株(0.47%)。检出曲霉排名前2位的依次为黄曲霉(56株，26.17%)和黑曲霉(21株，9.81%)。儿童耳炎病原真菌分布的具体数据如表 3所示。

2.3 儿童耳炎主要病原菌耐药分析 2.3.1 革兰氏阳性菌对抗生素的耐药性

儿童耳炎感染的革兰氏阳性菌主要是金黄色葡萄球菌和链球菌。其中，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率最高(86.94%)；其次是大环内酯类抗生素，包括红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和克林霉素，大部分耐药率超过了50%，对克林霉素的耐药率为26.58%；对四环素的耐药率为19.37%；对氨基糖苷类抗生素及喹诺酮类抗生素的耐药率较低，小于5%；而对利奈唑胺和万古霉素全敏感；对苯唑西林耐药提示为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)，占21.17%。

肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药率最高，包括红霉素和克林霉素，耐药率分别达到了98.88%和92.13%；其对四环素的耐药率也高达92.13%；其次是对复方新诺明耐药(85.39%)；其对二代头孢类抗生素头孢呋辛的耐药率较高(89.89%)，但对三代头孢抗生素头孢曲松则较为敏感，耐药率仅24.72%。对美洛培南和阿莫西林/克拉维酸钾则较为敏感，耐药率分别为7.87%和1.12%。肺炎链球菌对青霉素、万古霉素、利奈唑胺、利福平及左氧氟沙星全敏感。

主要革兰氏阳性菌对抗生素耐药性的具体数据如表 4所示。

2.3.2 革兰氏阴性菌对抗生素的耐药性

儿童耳炎感染的革兰氏阴性菌主要是铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌。其中，铜绿假单胞菌对青霉素类复合酶抑制剂、头孢类、碳青霉烯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、氨曲南等抗生素的耐药率较低，均小于5%。对哌拉西林/他唑巴坦和多粘菌素B则全敏感。对美洛培南和亚胺培南耐药的菌株提示为耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa, CRPA)，占比为1.33%。另外，药敏试验数据显示：流感嗜血杆菌对复方新诺明的耐药率最高(42.31%)，对氨苄西林的耐药率次之(23.08%)，继而对二代头孢(包括头孢呋辛和头孢克洛)的耐药率为11.54%，对阿莫西林/克拉维酸、氯霉素、氧氟沙星、头孢噻肟和利福平均为敏感。革兰氏阴性菌的耐药性数据如表 5所示。

2.3.3 主要念珠菌对抗真菌药物的耐药性

儿童耳分泌物分离的念珠菌主要为近平滑念珠菌和白念珠菌。表 6列出了这两种念珠菌对三唑类(包括氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑)、多烯类(两性霉素B)及氟胞嘧啶抗真菌药物的药敏试验情况。其中，近平滑念珠菌对三唑类抗真菌药物均为敏感，对两性霉素B及氟胞嘧啶的耐药率分别为27.27%和18.18%。白念珠菌对三唑类抗真菌药物的耐药性比近平滑念珠菌高，对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的耐药率分别为39.47%、47.37%和60.53%。但白念珠菌对两性霉素B的耐药性比近平滑念珠菌低，所检出的38株白念珠菌对两性霉素B表现为全敏感。白念珠菌对氟胞嘧啶的耐药率(5.26%)也要比近平滑念珠菌的耐药率低。

3 讨论

本研究结果表明，南宁地区儿童耳炎最常见的病原菌为细菌(70.30%)，其中以革兰氏阳性球菌为主(69.04%)，金黄色葡萄球菌最为多见(45.21%)，其次是肺炎链球菌(18.13%)。但真菌性耳炎也占一定的比例(26.32%)，其中最常见的真菌为黄曲霉(26.17%)和近平滑念珠菌(25.70%)，其次是白念珠菌(17.76%)和黑曲霉(9.81%)。本研究中南宁地区儿童耳炎病原菌的分布特征与上海复旦大学附属儿科医院的研究结果相近^[5]。比较两地区儿童耳炎分离的主要病原菌的药敏试验情况，均发现金黄色葡萄球菌对青霉素和大环内酯类的耐药率高，而铜绿假单胞菌对大多数抗生素则表现出敏感。药敏试验结果不同的是，上海地区分离的肺炎链球菌对青霉素中度耐药(57.1%)，而南宁地区分离的肺炎链球菌对青霉素全敏感。所以，临床医生在经验性使用抗生素治疗儿童耳炎时，应参考各地区的药敏流行特征。

本研究结果与北方地区研究结果相比，例如吉林^[6]及天津^[7]包括儿童和成人耳炎病原菌研究的报道，发现南北地区最常见的革兰氏阳性菌均为金黄色葡萄球菌，而最常见的革兰氏阴性菌均为铜绿假单胞菌，真菌性耳炎均以黄曲霉、黑曲霉、近平滑念珠菌和白念珠菌为主，且药敏试验结果相似。不同的是，南方地区肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检出率较高，而产气肠杆菌及杂曲霉的检出率在北方地区较高。南北地区耳炎病原菌的构成还是存在一定的差异。

在本研究中，耳部细菌合并真菌感染的患儿有21例(3.37%)，以金黄色葡萄球菌合并黄曲霉(5例)或白念珠菌(5例)为主，混合性感染的报道较少，但应该引起临床重视。治疗时须联合使用抗生素和抗真菌药物，确诊后应根据培养及药敏试验结果合理选择抗生素及抗真菌药物。

相关研究报道认为，不能忽视厌氧菌及病毒性耳炎^[8-9]。但耳分泌物标本并未常规进行厌氧菌培养，目前实验室也缺少针对耳分泌物病毒的检出方法，所以耳部感染厌氧菌和病毒时可能会漏检。在临床医生怀疑厌氧菌性耳炎时，本文建议用注射器抽取脓性分泌物送厌氧培养，以便检出厌氧菌，从而明确诊断及治疗。对于病毒性耳炎，本文建议开展相关聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测项目。

耳念珠菌在美国等地区由于其高度耐药并引起院内感染暴发而被称为“超级真菌”^[10-11]，其于2009年首次从日本一位住院老年患者外耳道中分离^[12]。但我国耳念珠菌感染发生率较低，未曾引起院内感染暴发，且我国分离的耳念珠菌除了对氟康唑耐药外，对其他抗真菌药物表现出敏感，所以国内对耳念珠菌不必过度恐慌^[13]。本研究中耳分泌物共分离出念珠菌103株，但并未分离出耳念珠菌，也符合我国耳念珠菌感染发生率低的现状。

本研究的优点在于样本量大，所纳入的样本来源于省级妇儿专科医院，具有一定的代表性。且本研究统计分析了念珠菌的耐药性，完善了本地区儿童耳炎念珠菌感染的药敏流行特征研究。本研究的不足之处在于本实验室并未开展对丝状真菌的药敏检测，所以未能给出本地区曲霉的耐药流行特征。但丝状真菌的耐药变迁相对于细菌而言较为稳定，既有研究指出曲霉对伏立康唑、艾沙康唑及泊沙康唑较为敏感，对氟康唑耐药，对棘白菌素类抗真菌药物的耐药性高，大部分曲霉对两性霉素B敏感，而土曲霉对两性霉素B天然耐药^[14-15]。所以在未得到培养结果之前，真菌性耳炎可先经验性使用伏立康唑治疗。