2023, Vol. 18
2. 云南省第一人民医院感染性疾病及肝病科, 云南 昆明 650032
2. Department of Infectious Diseases and Liver Diseases, The First People's Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，因早期症状不明显而难以被察觉，当患者确诊时大多已处于中晚期[1]。CRC在我国恶性肿瘤中的发病率居第2位，死亡率居第4位[2]。目前，针对CRC的治疗方式主要有手术治疗、化疗和免疫治疗[3]，但效果和预后并不理想[4]。因此，亟须探索治疗CRC的新策略。
有研究报道，CRC患者体内肠道菌群严重紊乱，致病性大肠埃希菌、粪肠球菌、脆弱拟杆菌、牛链球菌及核梭杆菌等细菌的丰度升高[5]。因此，调节肠道菌群对治疗和预防CRC具有潜在的临床价值，采用靶向肠道细菌的手段治疗CRC可能是未来的研究热点[6]。基因编辑技术在基因治疗、细菌设计、开发工程菌株等方面的应用已获得肯定，利用基因编辑肠道细菌治疗CRC的研究也取得了一定的成果。例如，Canale等[7]在大肠埃希菌Nissle1917(Escherichia coli Nissle 1917，EcN)中删除精氨酸抑制基因ArgR并向瘤内注射改造后的EcN，发现EcN能将肿瘤内的代谢废物氨转化为可增强肿瘤免疫的L-精氨酸，从而促进细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)的表达。此类研究为基因编辑肠道细菌治疗CRC提供了一定的参考依据。本文主要从基因编辑工程菌和基因编辑直接改造肠道细菌2个方面阐述对CRC的影响，评析靶向肠道细菌基因的基因编辑技术研究现状，总结当前CRC治疗的局限性及未来面临的挑战，从而探讨未来基因编辑肠道细菌治疗CRC的可行性。
1 肠道菌群与CRC肠道菌群是肠道内存在的庞大微生物群，在提供营养、参与代谢、机体免疫、抗菌及抗癌等方面发挥重要作用[8-9]。肠道菌群紊乱与CRC的发生、发展密切相关，调节肠道菌群对CRC有一定的治疗作用[10]。
1.1 肠道菌群紊乱促进CRC的发生、发展研究表明，CRC患者体内肠道菌群出现严重失调[11]。对CRC患者的粪便和肠黏膜组织样本进行16S rRNA测序，结果显示，与健康对照组相比，CRC患者的肠道菌群多样性和丰度降低[12-13]。Wang等[14]对46例CRC患者和56例健康人的粪便样本进行焦磷酸测序分析，发现CRC患者肠道内优势菌群的丰度发生了明显改变，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门的细菌丰度升高，而拟杆菌门、梭杆菌门的细菌丰度降低。肠道菌群紊乱会导致肠黏膜屏障受损，一些肠道致病菌可通过以下途径影响CRC的发生机制，包括DNA损伤，相关代谢物产生，细菌毒素和黏附素产生，微生物相关分子模式激活，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、信号转导和转录激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3，STAT3)、Wnt/β-Catenin等信号通路改变，以及促炎反应发生等(见图 1)[15-18]。
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| 注：肠道菌群紊乱可通过多种机制影响CRC的发生，包括代谢物、细菌毒素、黏附素、微生物相关分子模式等。目前，采用基因编辑技术改造CRC相关细菌以改善CRC进展的方式主要有2种：①利用基因编辑技术和生物合成技术，将CRC相关肠道菌群设计成基因工程菌，发挥抗肿瘤作用；②直接编辑CRC相关肠道细菌中的关键基因，如敲除致癌基因和增强抗癌基因表达。 图 1 肠道菌群紊乱与CRC致病机制及基因编辑肠道细菌治疗CRC的流程 Fig. 1 The pathogenic mechanism of CRC and intestinal flora disturbance and the flowchart of gene-edited intestinal bacteria for CRC treatment |
肠道致病菌可通过毒力因子直接黏附于肠道上皮细胞，产生毒素，造成肠上皮细胞DNA损伤。Mima等[19]发现，具核梭杆菌DNA的相对数量与CRC患者的死亡率呈正相关，其在细菌细胞表面表达黏附素FadA，该因子可通过激活CRC细胞中的Wnt/β-Catenin信号通路而促进CRC进展。肠道致病菌还能通过诱发慢性炎症使炎性细胞产生活性氧的方式导致肠上皮细胞DNA损伤，这种突变可增强癌基因表达，抑制抑癌基因发挥作用，最终诱导肠上皮组织癌变[20-21]。部分肠道微生物可直接致癌或在肿瘤相关微环境中作为机会微生物增殖[22]。例如，Kordahi等[23]发现，脆弱拟杆菌可在结肠息肉附近黏膜处通过激活Toll样受体4 (toll-like receptor 4，TLR4)及NF-κB信号通路诱发炎症反应，能促进息肉癌性病变。随着研究的不断深入，肠道菌群紊乱促进CRC发生的新机制不断被发现，这对明确肠道菌群与CRC发生、发展之间的关系至关重要。
1.2 调节肠道菌群在CRC防治中的潜能及局限肠道菌群紊乱可促进CRC的发生与发展。因此，调节CRC患者的肠道菌群对CRC可能有一定的预防和治疗作用，还可改善免疫治疗或缓解化疗带来的不良反应。这些调节方式包括补充益生菌、益生元、后生元，给予抗生素，以及粪菌移植[24]。然而，调节肠道菌群存在一定的局限性。例如：具有基础疾病的患者口服益生菌可能会导致局部或全身感染[25]；频繁使用抗生素(如青霉素和喹诺酮类抗生素)可能导致宿主免疫稳态长期失调，增加了CRC发病风险[26-28]；免疫缺陷患者粪菌移植后发生感染并发症的概率增加[29]。因此，如何打破利用肠道菌群防治CRC的局限性，改善靶向治疗的效果，可能成为该领域的研究热点。
2 基因编辑肠道细菌与CRC治疗 2.1 基因编辑概述基因编辑即通过碱基的删除、替换或修正，对基因特定位点进行修饰，影响基因转录、翻译，最终通过合成能发挥特定生理作用的蛋白而产生预期效果。目前，常用的基因编辑方式为成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)基因编辑系统，由CRISPR、Cas9和向导RNA(guide RNA，gRNA)组成。其原理为使用CRISPR/Cas9系统切割和破坏细胞外入侵的DNA，并利用gRNA引导和Cas9剪切敲除或替换不良基因。该技术已成为创建动物模型、研究和治疗人类遗传性疾病最有希望的工具之一[30-31]。相关研究表明，基因编辑肠道细菌在CRC治疗中具有潜力。
2.2 基因编辑肠道细菌与CRC治疗目前，通过基因编辑CRC相关细菌来改善CRC进展的方式主要有以下2种：一种是利用基因编辑技术和生物合成学等技术将CRC相关肠道菌群设计成基因工程菌，从而发挥抗肿瘤作用；另一种是通过基因编辑CRC相关细菌的关键基因来治疗疾病，如敲除致病基因、增强抗病基因表达。
2.2.1 基因编辑工程菌利用基因编辑技术将肠道细菌改造成基因工程菌进而调节肿瘤免疫微环境，是目前癌症治疗研究的热点。对特定肠道细菌进行基因工程化改造，不仅能削弱野生菌株的毒性，还可增强其靶向定位于肿瘤的能力。基因编辑工程菌主要通过靶向定植于肿瘤，开发合适的细菌底盘作为药物载体，以增强肿瘤微环境的免疫反应及靶向功能，或与其他生物技术和非生物技术联合应用，以及通过研发癌症疫苗等方式来治疗肿瘤[32]。目前，采用基因工程菌治疗CRC主要有2种方式，一是对工程菌进行基因编辑使其定植于肿瘤部位发挥抗肿瘤作用，二是将工程菌改造为具有搭载药物能力的载体，精确定位于肿瘤区域后释放靶向药物[33]。目前，已成功改造的肠道细菌有减毒基因型、营养缺陷型、诱导型的大肠埃希菌、沙门菌(Salmonella)、双歧杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、艰难梭菌等[34-35]。应用比较广泛的是EcN和鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)。
CRC治疗研究中最常用的工程菌是EcN。其能在HT-29 CRC细胞中上调抑癌基因PTEN和凋亡基因Bax，下调癌基因AKT1和凋亡抑制基因Bcl-xL，进一步调节Bax/Bcl-xL和AKT/PTEN信号通路，从而发挥抗癌特性[36]。Leventhal等[37]运用基因编辑技术删除EcN SYNB1891中的dapA和thyA基因，使其作为干扰素基因刺激因子的载体，通过TLR4等模式识别受体激活先天性免疫信号通路，发挥抗肿瘤作用。在临床试验中，Synlogic公司利用EcN SYNB1891菌株在晚期实体瘤或淋巴瘤患者中进行Ⅰ期临床试验(NCT04167137)，发现该菌株能激活抗原呈递细胞并呈递肿瘤抗原，引发抗肿瘤免疫应答，从而增强抗肿瘤效果。
Canale等[7]研究发现，删除EcN中的精氨酸抑制基因ArgR并向瘤内注射EcN使其在肿瘤中定植，能将肿瘤内的代谢废物氨转化为可增强肿瘤免疫的L-精氨酸，促进PD-L1表达，从而对结直肠肿瘤发挥一定的治疗作用。Yan等[38]删除EcN中的adhE或ldhA基因，让偶氮甲烷诱导的结肠炎模型小鼠口服改造后的EcN(5×1010单位)，发现EcN能定植于肠道结肠炎部位。对粪便样本进行16S rRNA测定，发现粪便样本中的有益菌Akkermansia spp.的丰度持续升高，同时液相色谱-串联分析发现肠道微生物代谢物——酮体-3-羟基丁酸酯和短链脂肪酸的水平大幅度提高，而这2种代谢物可通过减轻炎症来缓解结直肠炎，表明此方法对结直肠炎相关CRC治疗可能有一定的益处。Ho等[39]通过基因编辑技术在EcN中插入YeF-I1黑芥子酶表达基因和INP-HlpA基因，与CRC细胞共培养，发现改造后的EcN能与CRC细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合，分泌的黑芥子酶能将膳食中的硫代葡萄糖苷转化为具有抗肿瘤活性的有机小分子萝卜硫烷，而萝卜硫烷对癌细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用。
关于基因编辑鼠伤寒沙门菌治疗CRC的研究也有一定进展。Yu等[40]带领港药溶瘤生物制药有限公司研发团队，研究证实基因编辑改造后的鼠伤寒沙门菌(命名为YB1)对实体瘤有治疗效果。他们将鼠伤寒沙门菌SL7207中的必需基因ASD删除，插入受缺氧启动子控制的构建体，导致YB1菌株携带抗癌药物进入肿瘤内部低氧区并大量增殖，实体瘤内部抗癌药物浓度升高，从而达到抑制肿瘤生长、溶解肿瘤的目的。该团队还证实，YB1菌株可激活自然杀伤细胞，促进其分泌γ干扰素，识别已转移的癌细胞并产生细胞毒性，从而抑制转移[41]。此外，Chung等[42]利用基因编辑技术敲除戊糖片球菌染色体上的alr基因，将其作为呈递抗癌药物的载体及药物输送系统，携带从鼠李糖乳杆菌CBTLR5中分离出的一种可治疗CRC而命名为P8的蛋白。偶氮甲烷或葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的结肠炎相关CRC模型小鼠口服改造的戊糖片球菌后，不仅菌群分类多样性恢复，肿瘤体积也显著缩小(P＜1×10-6)。Chowdhury等[43]基因编辑了一株包含同步裂解回路(synchronized lysis circuit，SLC)的非致病性大肠埃希菌，将其作为给药系统，在肿瘤内定植并在肿瘤微环境中特异裂解释放一种CD47纳米拮抗剂(nanobody antagonist of CD47，CD47nb)，可有效刺激T细胞活化，诱发特异性免疫反应，从而使瘤体缩小并降低转移率。
Jin等[44]运用CRISPRi-dCpf1和Group Ⅱ intron 2种基因编辑手段，对筛选出的38株引入外源质粒的梭菌纲菌株的基因编辑可行性进行验证，发现菌株S122具有使初级胆汁酸发生7α-脱羟基化产生次级胆汁酸的活性，敲除其7α-脱羟基途径中的关键基因baiH，并将baiH突变株和野生型菌株分别定植于经DSS诱导结肠炎且具有复杂菌群的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级模型小鼠，结果显示baiH突变株的抗炎效果较野生株更好，这可能是由突变株定植小鼠肠道中具有促炎作用的细菌Erysipelotrichaceae的丰度显著降低导致。该研究或可为通过基因编辑技术敲除baiH基因治疗结肠炎相关CRC提供新的思路。Russell等[45]对大肠埃希菌进行基因改造，使其表达胆盐水解酶和抗炎介质白细胞介素10，并将其移植到小鼠肠道，发现其能通过改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐
量而治疗糖尿病。胆盐水解酶被证实在结直肠肿瘤中有促癌作用，被认定为CRC的潜在治疗靶点[46]。还有研究表明，机体内胆汁酸与肠道菌群互作稳态被打破可能导致CRC的发生。因此，如果产生胆汁酸代谢产物如胆盐水解酶及7α-脱羟基酶的菌群过少，会造成缺乏次级胆汁酸，导致肠道上皮细胞中的法尼醇X受体活性降低，从而加速肠道炎症的发展并诱导CRC的发生[47]。
综上所述，基因编辑工程菌在增强肿瘤治疗效果、抑制肿瘤细胞增殖方面具有积极意义。改造工程菌靶向肿瘤部位，或使工程菌作为药物载体携带抗癌药物靶向到CRC免疫微环境等常用的基因编辑手段具有一定的临床应用价值，尤其是局部给药更有优势。这些研究为今后通过基因编辑工程菌治疗CRC开辟了新途径，也为抗肿瘤药物的开发和使用提供了新方向(见图 1)。
2.2.2 基因编辑直接改造肠道细菌通过基因编辑技术删除CRC相关肠道致病菌的基因可能是治疗CRC的另一种策略，但目前仍少见直接编辑肠道细菌中关键基因的研究报道。研究表明，一些基因毒素能直接与DNA结合，造成DNA双链断裂，从而促进CRC的发生、发展[48]。Wilson等[49]研究表明，pks岛阳性大肠埃希菌可产生具有基因毒性的次级代谢产物colibactin，colibactin中的环丙烷环能与相应宿主细胞的双链DNA发生交联反应。另有研究表明，colibactin可选择性诱导宿主DNA基序(AAWWTT)损伤，从而导致CRC的发生、发展[50]。因此，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术特异性删除大肠埃希菌的毒力基因pks，降低肠道内基因毒素的产量，可缓解CRC进展，改善患者预后和提高生存质量。除pks岛阳性大肠埃希菌，其他CRC相关肠道致病菌还包括产肠毒素脆弱类杆菌[51]、粪肠球菌[52]、厌氧消化链球菌[52]、牛链球菌[53]等。如果能通过基因编辑删除肠道致病菌中的致病基因，可能有益于致病菌的改造和缓解CRC的进展。
基因编辑技术在改造益生菌基因方面也有巨大潜力。Zhou等[54]采用CRISPR/Cas9技术删除丁酸梭状芽孢杆菌中的基因adhE和spo0A，促使丁酸盐产量大幅提高。而丁酸盐能抑制肠道炎症和CRC细胞增殖，促进结肠末端连接、吻合功能恢复[55-56]。CRC患者肠道中罗伊乳杆菌及罗伊菌素水平均降低，补充罗伊乳杆菌或罗伊菌素可降低核糖体生物合成速率，有效抑制CRC细胞的增殖[57]。如果能通过基因编辑技术对乳酸杆菌、双歧杆菌等CRC相关肠道益生菌的关键基因进行改造，或能通过增强其抗癌基因的表达而缓解和治疗CRC。
综上所述，基因编辑直接改造肠道细菌可能是治疗CRC的一种新策略，尤其是通过CRISPR/Cas9技术靶向删除CRC相关致病菌中的致癌基因，或删除、引入益生菌中的CRC相关特定基因，可进一步拓宽基因编辑肠道细菌的思路，但具体疗效及不良反应还须进一步研究和证实(见图 1)。
3 应用局限及挑战基因编辑肠道细菌在治疗CRC领域有巨大的潜力，也存在一些问题。首先，肠道定植是CRC治疗中极为关键的一环。上述2种基因编辑肠道细菌方式中，将基因编辑工程菌作为载药系统，通过口服给药或在肿瘤局部、肠道内给药的方式，比基因编辑直接删除有害菌基因及改造有益菌基因的方式更具有优势。这是因为肿瘤局部和肠道内给药能更好地使工程菌作为载药系统而在肠道内定植，从而更好地进行靶向治疗。鉴于目前科学技术的局限性，人们尚未解决有害菌基因删除和有益菌基因改造后的肠道定植问题。
其次，引入何种基因作为精准治疗的靶点是未来肿瘤治疗研究的重点。基于肠道细菌相关基因来治疗CRC的研究较少，还须参考和借鉴其他相关疾病。例如，Wang等[58]发现梭菌属能激活免疫调节亚型三阴性乳腺癌患者的抗肿瘤免疫应答，选用梭菌属代谢产物氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)进行瘤内注射，能诱导癌细胞焦亡，向肿瘤微环境释放炎性因子，肿瘤区域出现CD8+ T细胞募集和功能活化，继而促进免疫细胞浸润，发挥抗肿瘤作用。由于肠道菌群代谢产物与CRC的发病机制密切相关，未来可引入对CRC有益的代谢产物进行基因编辑，选择合适的工程菌作为载体，从而更好地发挥抗肿瘤作用。因此，未来须根据相关基因进行针对性研究。
此外，脱靶效应是限制基因编辑技术应用于临床的巨大挑战。脱靶效应是由单链gRNA与DNA的碱基错配导致原本的基因功能发生改变，甚至导致疾病加重。未来应加强脱靶检测并选用合适的单链gRNA设计工具[59-60]。因此，通过提高CRISPR靶向特异性及寻找并选择有效的细菌物种和基因靶点，尽量避免脱靶效应的产生，是将基因编辑用于临床时须关注的重点之一。
4 结语综上所述，通过基因编辑工程菌和基因编辑直接改造肠道细菌对于治疗CRC有巨大的研究价值，而且对提高CRC治愈率、降低死亡率、完善临床指南有重要意义。尤其是以细菌为底盘搭载药物的工程菌，不仅具有天然的抗肿瘤活性和靶向肿瘤的能力，还在基因改造方面具有兼容性和易用性，这些优势为基因编辑工程菌治疗CRC奠定了坚实的基础。但目前还存在一定的应用局限，包括亟待解决的细菌肠道定植问题、重点基因的研究及如何降低脱靶效应的发生率等。因此，在将基因编辑技术全面应用于临床之前，还须进一步通过动物实验来检测结果的稳定性和可靠性。但相信随着科学技术的不断发展，基因编辑肠道细菌会为精准治疗CRC带来福音。
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