2023, Vol. 18
2. 上海市嘉定区疾病预防控制中心，上海 201800;
3. 上海市青浦区疾病预防控制中心，上海 201799
2. Jiading District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 201800, China;
3. Qingpu District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 201799, China
柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3，CVB3)是单股正链无包膜RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，在B组肠道病毒中常见。大多数CVB3感染是无症状的，但也可能引起病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)、胰腺炎、无菌性脑膜炎(asepic meningitis，AM)、手足口病(hand, foot, and mouth disease，HFMD)等的暴发流行[1-3]。
上海自2012年启动脊髓灰质炎病毒环境污水监测网络以来，建立了肠道病毒数据库，对污水中的肠道病毒病原谱构成以及不同肠道病毒基因变异变迁规律进行了研究。环境污水中肠道病毒基因型别众多，不同的肠道病毒有不同的流行规律。CVB3是环境污水中检出率较高的肠道病毒基因型。以往对CVB3的研究主要围绕其引起的AM、VMC等相关疾病[2, 4-5]。2014—2016年美国国家肠道病毒监测系统显示，CVB3是引发肠道病毒感染的第5位常见基因型别[6]。有文献报道，CVB3也是除脊髓灰质炎病毒外导致急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)的病原体之一[7-8]。近年来，不少文献报道了由CVB3导致的HFMD暴发，其逐渐成为引起HFMD的主要病原体之一[3, 9]。本研究通过探讨环境污水监测中的CVB3分离株与实验室AFP病例和健康儿童肠道病毒监测中的CVB3分离株的VP1区基因特征，分析不同来源的CVB3的循环动态变化，为上海市预警CVB3引发的HFMD提供基础资料，为CVB3相关疾病的科学防控工作提供相关依据。
1 材料与方法 1.1 标本来源本研究所用标本主要来自2012—2021年的环境污水监测，部分来自1989—2021年的健康儿童肠道病毒监测和1993—2021年的AFP病例监测。污水样本采用阴离子膜吸附-超声波振荡法浓缩[10]。健康儿童和AFP病例的粪便标本按照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)《脊髓灰质炎实验室手册》中推荐的方法进行处理[11]。
1.2 病毒分离与鉴定将处理好的污水浓缩液样本接种于人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma，RD) 细胞和人喉癌上皮细胞(human laryngeal carcinoma epithelial cell，Hep-2)进行病毒分离培养，将处理好的健康儿童样本、AFP病例样本接种于RD细胞进行病毒分离。待样本产生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，收获病毒，冻存于-20 ℃，待检测。
根据QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(Qiagen；货号：52904)说明书，从140 μ L阳性分离物中提取50 μ L病毒核酸。采用008-013、012-011通用肠道病毒引物[12]，将每份阳性分离物进行反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR)(TaKaRa；One-step RNA PCR Kit试剂盒；货号：RR055A)。将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，阳性产物委托生工(上海)股份有限公司进行测序。原始序列使用Sequencher 5.4.5软件进行整理和拼接，与GenBank数据库中的肠道病毒参考株进行BLAST比对分析，鉴定肠道病毒型别。
1.3 CVB3全长VP1区序列测定和分析对于鉴定为CVB3的病毒分离物，采用B组肠道病毒通用引物HEVBS695/R132[13]和CVB3特异性引物[14]进行RT-PCR，目的基因片段为900 bp左右。电泳鉴定后，阳性产物委托生工(上海)股份有限公司进行测序。原始序列使用Sequencher 5.4.5软件进行整理和拼接，通过软件MEGA 10.0.4运用最大似然法(maximum likelihood，ML)构建系统发育树，建树自展值(bootstrap)检验1 000次。
2 结果 2.1 CVB3的分离鉴定本研究收集CVB3毒株的时间跨度为1989—2021年，共收集120株。其中72株来自2012—2021年的污水标本，41株来自1989—2021年的健康儿童粪便标本，7株来自1993—2021年的AFP病例粪便标本。环境污水标本中的CVB3毒株分别于2012、2015、2016和2021年分离获得，主要集中于春夏季(5—7月)。健康儿童标本分别于2004、2005和2008年出现CVB3毒株分离高峰(见图 1)。
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| 图 1 1989—2021年上海市CVB3分离情况 Fig. 1 Isolation of CVB3 in Shanghai during 1989 and 2021 |
120株不同来源的CVB3分离株中，有108株获得VP1全长序列(其中环境污水分离株70株、健康儿童分离株32株、AFP病例分离株6株)。CVB3的VP1全长为852个核苷酸，共编码284个氨基酸。采用Bioedit软件对108条CVB3序列进行相似性分析，结果显示，1989—2021年CVB3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大，分别为78.7%~100%和93.3%~100.0%；与CVB3原型株Nancy核苷酸和氨基酸的相似性分别为77.3%~80.6%和94%~97.1%。
2.3 遗传进化分析为了解上海CVB3的系统进化特征，从GenBank中下载289条1956—2020年13个国家的CVB3分离株VP1(852 bp)编码区序列(截至2022年8月28日)(其中HFMD病例78条、AFP病例23条、AM病例9条、健康儿童6条、污水13条)。删除高度同源序列，挑选有时间和地域代表性的CVB3，本研究共纳入115株CVB3的VP1编码区序列(包括50条上海分离株和65条其他国家和我国其他省份的分离株)，使用ML法构建系统发育树(见图 2)。
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| Notes: Shanghai CVB3 isolates were marked red.√ means CVB3 strains from AM cases; ■ means CVB3 strains from AFP cases; ★ means CVB3 strains from HFMD cases; ▲ means CVB3 strains from healthy children; ● means CVB3 strains from sewage. 图 2 CVB3上海分离株与各基因型代表株完整VP1序列的系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic analysis based on complete VP1 regions of CVB3 isolates in Shanghai and each representative CVB3 strain |
以VP1区基因亚型＞15%核苷酸差异为分型标准[15]，CVB3的进化树分为A~E 5个基因亚型，核苷酸差异>15%(15.6%~21.8%)。本研究中上海不同来源的CVB3分离株分别属于D、E基因亚型。原型株Nancy(GenBank号：M16572)属于A基因亚型。D基因亚型主要由中国、泰国、日本、俄罗斯、法国株组成。我国大部分CVB3株聚集在D基因亚型，时间跨度为1989—2020年，可分成3个分支(lineage1、lineage2、lineage3)。lineage1(绿色分支)主要为1989—2008年的CVB3分离株，上海1989—2001年健康儿童和AFP病例的CVB3分离株均位于lineage1。近10多年来没有lineage1 CVB3相关序列信息，表明该分支已不是优势型别。从2004年开始，lineage2(蓝色分支)的CVB3分离株逐渐替代lineage1。D基因亚型的lineage2(蓝色分支)和lineage3(红色分支)包括了上海2004—2020年健康儿童、2015年AFP病例和2012—2016年环境污水(除2016年1株外)中的CVB3分离株。目前，D基因亚型的lineage2和lineage3分支交替流行，成为优势型别。
上海E基因亚型的CVB3分离株从2016年7月的嘉定区污水样本中获得，随后4年从环境污水中均未分离到CVB3。2021年2—7月在嘉定区和青浦区污水厂连续分离到E基因亚型CVB3，提示E基因亚型CVB3处于活跃期。上海E基因亚型CVB3与欧美、澳大利亚、广东HFMD分离株聚为一簇。2016年的HJ777-CVB3分离株与2021年污水CVB3分离株的核苷酸存在一定差异(9.3%~9.6%)，与NSW-V25/AUS/2015澳大利亚株(GenBank号：MF678314)核苷酸的相似性较高(93.5%)，提示2016年后的5年内E基因亚型CVB3不断在进化变异。上海2021年的污水CVB3分离株与2株广东HFMD株(GenBank号：OK643877、OK643882)的相似性高达97.8%~99.5%。
3 讨论本研究中，CVB3分离株出现的时间分布显示由于入选的上海市AFP病例和健康儿童基数太小，故流行周期不明显。2012—2021年环境污水监测中CVB3分离株的流行周期为3~5年，分离株高峰集中于春夏季，与HFMD监测系统中贵州省和广东省的CVB3流行周期较为一致，但江苏省和山东省AM监测系统中CVB3呈现持续流行的特点[9, 16]。由于监测系统口径不一致，CVB3的流行特点还有待进一步研究，这提示建立完善的肠道病毒监测系统有助于充分了解CVB3等肠道病毒的传播动态。
目前，我国大陆地区CVB3优势基因型为D基因亚型，分为3个分支，每个分支内均显示上海不同来源的毒株间亲缘关系较近。近年来交替流行的lineage2和lineage3分支内，2012、2015和2016年上海污水CVB3分离株与2011—2017年广东、山东、浙江等多个省份AM病例和HFMD病例分离株的亲缘关系较近。山东省和广东省的长期环境污水监测结果显示，CVB3是污水中检出率较高的肠道病毒[17-18]，表明CVB3在环境和人群中的隐性循环已有较长时间，CVB3感染临床病例与当地生活污水中的CVB3分离株密切相关。目前，上海尚缺乏CVB3引起HFMD的相关文献和资料，须加强对CVB3引起HFMD的监测和基础研究，以应对可能的暴发。
E基因亚型CVB3在全球范围内分布广泛，但在2020年之前我国未有其数据报道，推测此亚型在我国不是优势基因型别。杨倩等[19]首次报道在2020年广东省HFMD监测中发现了输入性E基因亚型CVB3分离株的流行。本研究也显示，早在2016年就从上海污水中分离到了并不是优势型别的E基因亚型CVB3，其后5年未再分离到，直到2021年再次分离到E基因亚型CVB3，但未分离到D基因亚型CVB3。因此，与过去9年流行的基因亚型不同，该输入性E基因亚型CVB3可能在我国逐渐成为新的优势基因型别。目前，尚未有文献报道E基因亚型CVB3引起的上海HFMD病例。
受肠道病毒感染的个体无论有无临床症状，均会通过粪便持续3~4周向外环境排出病毒，病毒颗粒在外环境中可存活一定时间，并保持感染性。相关部门通过定期监测环境污水中的肠道病毒型别变化和基因特征，可了解人群中的肠道病毒病原谱和动态循环变化。WHO在全球脊髓灰质炎消灭计划(Global Polio Eradication Initiative，GPEI)中提出，将环境污水监测作为AFP病例监测的一种补充方法[20]。多项研究表明[21-22]，环境污水监测中的肠道病毒与病例监测中的肠道病毒密切相关。引发HFMD的主要病原体具有多变性和交替性，除了熟知的肠道病毒A组71型(enterovirus A71，EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16，CV-A16)外，其他多种肠道病毒也逐渐成为引发国内HFMD的优势基因型[3, 23]，但研究CVB3引发HFMD的报道尚不多。因此，持续对环境污水进行监测，可为上海市肠道病毒相关传染病预防和控制提供数据支撑。
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