2023, Vol. 18
2. 遵义市第一人民医院神经内科，贵州 遵义 563003
2. Department of Neurology, First People's Hospital of Zunyi, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
结核性胸膜炎(tuberculous pleurisy，TBP)是常见的胸膜疾病，是结核杆菌及其自溶产物、代谢产物进入人超敏机体的胸膜腔而引起的胸膜炎症，属于肺外结核病的一种[1-2]，也可由全身性疾病引起[3]。该病多数起病较急，患者可表现为结核中毒症状(以发热最常见)、胸痛、呼吸困难。当患者出现中到大量胸腔积液时，可伴有肺不张，这进一步加重了呼吸困难的症状[4]。
微小RNA(microRNA, miRNA)由内源基因编码，长度约为22个核苷酸，可通过降解mRNA或抑制翻译来调节转录后蛋白编码基因的表达[5]。它们在动植物中参与转录后基因表达的调控，在血清和体液中较稳定，并在细胞生长、分化、凋亡、代谢及病毒感染、肿瘤发生等各种生理、病理过程中发挥着重要作用[6-9]。机体内大多数细胞产生的miRNA会分泌到外泌体，然后进入循环被其他细胞摄取[10]。外泌体miRNA在细胞内具有多种重要的调节方式[11]，且其性质稳定、含量较高、溯源性强、能够无创检测，对疾病诊断的意义重大[12]。
目前，结核性胸膜炎的诊断主要依靠病史、临床表现、影像学检查、胸膜活检等，确诊率较低，且由于胸腔积液中细菌载量低，使得涂片法和培养法检测的敏感性很低[13]，特别是与恶性胸膜疾病及其他感染性胸膜疾病鉴别诊断困难[14]。因此，需要开发灵敏度高、准确度高、可操作性强的诊断方法。而miRNA在各种临床样本中稳定性极高且能够快速准确定量，在鉴别诊断良、恶性胸腔积液时有一定的价值，有望作为一种非侵袭性的生物标志物来追踪疾病[15-16]。因此，本研究通过前期应用高通量测序分析结核性胸膜炎患者血清和胸水中外泌体miRNA的差异表达谱，找出表达差异最明显的13种miRNA，再用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证结核性胸膜炎患者胸水和血清外泌体中13种miRNA的表达情况，以期望找到结核性胸膜炎的诊断和鉴别诊断的潜在生物学标志物。
1 方法 1.1 研究对象收集在遵义医科大学附属医院结核病区住院治疗、临床综合诊断为肺结核合并结核性胸膜炎患者的胸水和血清标本(即试验组)20例、肺炎(一般细菌性肺炎)合并炎性胸腔积液患者的胸水和血清标本(疾病对照组，即为对照组2)20例、健康体检者(健康对照组，即为对照组1)的血清标本20例。结核合并结核性胸膜炎患者符合临床结核病的诊断标准[17]，并排除患有免疫抑制性疾病如艾滋病、糖尿病或自身免疫性疾病等以及使用了免疫抑制剂的患者。肺炎患者须符合临床肺炎的诊断标准[18]。本研究通过了遵义医科大学附属医院伦理委员会审查。
1.2 方法与步骤 1.2.1 胸水和血清分离收集试验组和对照组2患者的胸水、全血标本各5 mL，健康对照组全血标本5 mL，混匀后以3 000 g离心力离心10 min，吸取上清液收集到无RNase的EP管中，再高速以12 000 g离心力低温离心15 min，再次收集上清液于-80 ℃保存备用。
1.2.2 外泌体提取和纯化严格按照外泌体提取和纯化试剂盒(购自辽宁润基生物科技有限公司)说明书操作，具体方法：①预处理：取出上述收集的胸水和血清上清液样本，室温解冻，以12 000 g离心力在4 ℃下离心15 min，去除细胞及碎片，将上清液吸入新管中；②纯化柱平衡：取1.0 mL平衡缓冲液加入纯化柱中(已放入收集管中)，300 g离心力离心2 min，弃滤液，纯化柱重新放入收集管中，待用；③外泌体结合：吸取1.0 mL步骤1中的上清液放入15 mL离心管中，加入结合缓冲液3.0 mL，颠倒混匀后将混合液分2次加入平衡柱中，300 g离心力离心2 min，倒掉滤液，将纯化柱再次放入收集管中；④外泌体洗涤：取1.0 mL洗涤缓冲液加入纯化柱中，300 g离心力离心2 min，再以1 000 g离心力离心2 min，弃去滤液和收集管；⑤外泌体洗脱：将纯化柱放入新的1.5 mL离心管中，加入300 μL洗脱液，室温静置5 min，300 g离心力离心2 min，将离心得到的溶液再加入纯化柱中，300 g离心力离心2 min，最后离心管中液体即为提取的外泌体。取部分用于透射电子显微镜观察外泌体的形态及大小。
1.2.3 外泌体RNA提取采用购买的外泌体RNA提取试剂盒(购自辽宁润基生物科技有限公司)进行RNA提取，操作方法：①取300 μL上述分离的外泌体溶液，加入等体积的裂解液A，涡旋振荡混匀30 s，室温放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。室温下12 000 g离心力离心10 min，取上清液转入一个新的无RNase的离心管中。加入150 μL裂解液B，封管，剧烈振荡15 s，室温放置5 min后12 000 g离心15 min，样品会分成3层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，取水相液体(上层)转移到新管中(避免吸取中间层)。记录水相所有液体体积，缓慢加入1.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后室温静置10 min。②将所有溶液和沉淀转入吸附柱，室温放置2 min，室温8 000 g离心30 s，离心后弃滤液，保留吸附柱。③洗涤：向吸附柱加入500 μL洗涤液A，室温8 000 g离心30 s，倒掉收集管中的滤液，重复洗涤1次，12 000 g离心力空离2 min以去除残余液体。打开吸附柱盖子室温下放置10 min，以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤液。④洗脱：将吸附柱转入1.5 mL离心管中，悬空滴加100 μL洗脱液A放置5 min，室温12 000 g离心2 min，将溶液收集到离心管中。使用Nano-300微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度。
1.2.4 RT-PCR检测miRNA逆转录过程(加尾法)：将2×miRNA RT混合溶液10 μL、miRNA RT酶混合物2 μL和Total RNA 2 μ g混合，加去RNA酶水定容至20 μL体系。混匀轻离心5 s，37 ℃温育60 min，85 ℃加热5 min，使用Nano-300微量分光光度计法测定cDNA浓度和纯度。余下的cDNA用反应液稀释50倍后作为模板进行荧光定量检测。
CFX96实时荧光定量PCR仪检测miRNA表达水平，反应体系如下：2×miRNA qPCR底物混合液10 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μ mol/L)，DNA模板2 μL(10 μ mol/L)，加去RNA酶水定容至20 μL。95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环(引物序列见表 1)。U6作为内参，通用下游引物。miRNA的相对表达量采用2—ΔΔCt法进行计算，-ΔΔCt=(实验组Ct值-内参Ct值)-(对照组Ct值-内参Ct值)，2-ΔΔCt＞1表示miRNA表达上调，2-ΔΔCt＜1表示miNRA表达下调。
| miRNA name | miRNA primer(5′ to 3′) |
| hsa-let-7a-3p | ccg gcg cta tac aat cta ctg tct ttc |
| hsa-let-7a-5p | ccg cgt gag gta gta ggt tgt ata gtt |
| hsa-let-7b-5p | ccg tga ggt agt agg ttg tgt ggt t |
| hsa-let-7c-5p | ccg ctg agg tag tag gtt gta tgg tt |
| hsa-let-7d-3p | gct ata cga cct gct gcc ttt ct |
| hsa-let-7d-5p | ccg cag agg tag tag gtt gca tag tt |
| hsa-let-7e-3p | gct ata cgg cct cct agc ttt cc |
| hsa-let-7e-5p | cgc gtg agg tag gag gtt gta tag tt |
| hsa-let-7f-5p | ggc gcc gtg agg tag tag att gta tag |
| hsa-let-7g-5p | cgc cgt gag gta gta gtt tgt aca gtt |
| hsa-let-7i-5p | cgc tga ggt agt agt ttg tgc tgt t |
| hsa-miR-126-3p | cgc tcg tac cgt gag taa taa tgc g |
| hsa-miR-122-5p | tcg tgg agt gtg aca atg gtg ttt g |
| U6 | gtcgtatccagtgcaggtccgaggtattcgcactg-gatacgacaaaaata |
采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理分析，miRNA相对定量的均值比较用独立样本t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 透射电子显微镜对外泌体的形态鉴定试剂盒提取的外泌体取一小部分用于透射电子显微镜观察外泌体的大小和形态，显微镜下观察显示，提取的外泌体囊泡形态呈球形中间凹陷，直径约30~100 nm，大小较为均一，结果如图 1所示。
|
| 图 1 外泌体形态 Fig. 1 Morphology of exosomes |
外泌体RNA属于小RNA，一般浓度较低，采用分光光度计分析A260/A280比值，均在1~1.6，部分低A260/A280比值样本并不影响下游实验，各样本RNA浓度值具体如表 2所示。
| number | Control group 1 | Control group 2 | Experiment group | |||
| Serum | Pleural fluid | Serum | Pleural fluid | |||
| 1 | 1.13 | 1.27 | 1.13 | 1.19 | 1.64 | |
| 2 | 1.29 | 1.37 | 1.65 | 1.30 | 1.52 | |
| 3 | 1.15 | 1.32 | 1.76 | 1.15 | 1.15 | |
| 4 | 1.67 | 1.49 | 1.40 | 1.40 | 1.68 | |
| 5 | 1.67 | 1.45 | 1.59 | 1.45 | 1.70 | |
| 6 | 1.47 | 1.45 | 1.59 | 1.45 | 1.70 | |
| 7 | 1.47 | 1.42 | 1.47 | 1.26 | 1.52 | |
| 8 | 1.43 | 1.42 | 1.47 | 1.26 | 1.52 | |
| 9 | 1.43 | 1.43 | 1.30 | 1.57 | 1.57 | |
| 10 | 1.46 | 1.43 | 1.30 | 1.57 | 1.57 | |
| 11 | 1.46 | 1.47 | 1.25 | 1.37 | 1.69 | |
| 12 | 1.30 | 1.47 | 1.25 | 1.37 | 1.69 | |
| 13 | 1.30 | 1.46 | 1.39 | 1.25 | 1.93 | |
| 14 | 1.15 | 1.46 | 1.39 | 1.25 | 1.93 | |
| 15 | 1.15 | 1.33 | 1.31 | 1.39 | 1.56 | |
| 16 | 1.45 | 1.33 | 1.31 | 1.39 | 1.56 | |
| 17 | 1.45 | 1.56 | 1.56 | 1.52 | 1.90 | |
| 18 | 1.56 | 1.56 | 1.56 | 1.52 | 1.90 | |
| 19 | 1.56 | 1.45 | 1.45 | 1.31 | 1.52 | |
| 20 | 1.41 | 1.45 | 1.45 | 1.31 | 1.52 | |
各组外泌体miRNA Ct值分析显示：与对照组1(control group1，control G1)血清外泌体miRNA表达的Ct值相比，对照组2(control group2，control G2)血清中有7种miRNA水平下降，试验组血清(serum)外泌体中有10种下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与对照组2胸水(pleural fluid)外泌体miRNA的Ct值相比，试验组(experiment group，Experi-G)胸水外泌体中有6种miRNA水平下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Ct值数据表示为平均值(mean，M)±标准差(standard deviation，SD)，具体如表 3所示。
| miRNA | Control G1 | Control G2 | Experi-G | |||
| Serum | Pleural fluid | Serum | Pleural fluid | |||
| hsm-let-7a-3p | 30.08±0.96 | 29.90±1.48 | 28.92±1.49 | 29.44±1.44 | 28.95±1.41 | |
| hsm-let-7a-5p | 30.81±1.70 | 28.80±1.43# | 29.47±2.00 | 27.84±2.13## | 28.83±0.28 | |
| hsm-let-7b-5p | 26.53±1.30 | 27.040±2.49 | 25.88±2.46 | 25.13±0.63 | 24.55±1.02 | |
| hsm-let-7c-5p | 29.45±0.94 | 27.96±1.23# | 28.28±1.78 | 26.92±0.55## | 26.91±0.81＄ | |
| hsm-let-7d-3p | 24.99±1.38 | 25.31±2.75 | 24.38±2.72 | 24.06±0.69# | 22.90±1.21 | |
| hsm-let-7d-5p | 29.49±0.99 | 28.45±1.54# | 28.99±2.40 | 27.96±2.29# | 27.49±1.08＄ | |
| hsm-let-7e-3p | 27.01±1.25 | 25.83±1.76# | 26.31±2.88 | 26.37±1.16 | 24.84±0.86 | |
| hsm-let-7e-5p | 30.15±1.34 | 28.93±1.41# | 29.14±1.47 | 27.92±2.07# | 27.95±0.98＄ | |
| hsm-let-7f-5p | 30.76±0.99 | 29.88±1.22# | 31.18±1.56 | 29.11±1.72# | 28.16±0.98＄＄ | |
| hsm-let-7g-5p | 31.63±1.38 | 30.62±2.29 | 30.08±1.27 | 29.83±1.88# | 28.19±0.84＄＄ | |
| hsm-let-7i-5p | 28.00±1.67 | 26.82±1.79 | 26.02±2.25 | 26.91±1.34# | 24.98±0.91 | |
| hsm-miR-126-3p | 30.00±0.98 | 27.78±0.78# | 30.05±1.31 | 27.63±1.64# | 28.99±0.84＄ | |
| hsm-miR-122-5p | 27.51±1.04 | 26.80±2.20 | 26.61±2.27 | 26.59±0.73# | 25.42±0.80 | |
| Note: Compared with control group1，#P＜0.05，# #P＜0.01；Compared with control group2，＄P＜0.05，＄ ＄P＜0.01. | ||||||
以U6作为内参，比较各组的外泌体miRNA的相对表达量，结果显示：与对照组1血清外泌体miRNA表达水平相比，对照组2血清外泌体中各种miRNA表达水平均有不同程度的升高，其中升高明显的有let-7a-5p、let-7c-5p、let-7i-5p和miRNA-126-3p，而试验组血清外泌体中miRNA表达水平升高得更明显，其中水平升高最明显的有let-7a-5p、let-7d-5p、let-7e-5p、miRNA-126-3p、let-7g-5p和let-7c-5p，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与对照组2胸水外泌体miRNA的表达水平相比，试验组胸水外泌体中miRNA水平普遍升高，升高较明显的有let-7f-5p、let-7g-5p、let-7d-3p，试验组患者胸水和血清外泌体中miRNA表达也存在差异，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。具体如表 4所示。
| miRNA | Control G1 Serum | Control G2 | Experi-G | |||
| Serum | Pleural fluid | Serum | Pleural fluid | |||
| hsm-let-7a-3p | 1.00±0.00 | 0.79±0.68 | 1.00±0.00 | 1.34±1.82 | 0.62±0.50 & | |
| hsm-let-7a-5p | 1.00±0.00 | 2.56±1.72* | 1.00±0.00 | 14.62±1.16 | 0.68±0.13 & & | |
| hsm-let-7b-5p | 1.00±0.00 | 0.84±0.89 | 1.00±0.00 | 1.41±0.55* | 1.35±0.96 | |
| hsm-let-7c-5p | 1.00±0.00 | 1.67±1.00* | 1.00±0.00 | 3.05±1.22** | 1.26±0.65 | |
| hsm-let-7d-3p | 1.00±0.00 | 1.05±1.13 | 1.00±0.00 | 1.05±0.54 | 1.64±1.32 | |
| hsm-let-7d-5p | 1.00±0.00 | 1.40±1.02 | 1.00±0.00 | 13.25±9.40 | 1.57±1.23 | |
| hsm-let-7e-3p | 1.00±0.00 | 1.53±0.93 | 1.00±0.00 | 1.03±0.85 | 1.22±0.68 | |
| hsm-let-7e-5p | 1.00±0.00 | 1.42±0.81 | 1.00±0.00 | 6.63±1.70 | 1.22±0.91 | |
| hsm-let-7f-5p | 1.00±0.00 | 1.07±0.63 | 1.00±0.00 | 2.65±2.35* | 4.16±2.33 & | |
| hsm-let-7g-5p | 1.00±0.00 | 2.00±1.97 | 1.00±0.00 | 3.38±3.48* | 1.86±1.11 | |
| hsm-let-7i-5p | 1.00±0.00 | 1.67±1.16* | 1.00±0.00 | 1.45±1.03 | 1.52±0.92 | |
| hsm-miR-126-3p | 1.00±0.00 | 2.40±1.06** | 1.00±0.00 | 4.24±4.17* | 1.01±0.46 | |
| hsm-miR-122-5p | 1.00±0.00 | 1.64±1.66 | 1.00±0.00 | 1.06±0.59 | 1.12±0.67 | |
| Note: Compared with control group1，*P＜0.05，* *P＜0.01；Compared with control group2，& P＜0.05，& & P＜0.01. | ||||||
外泌体成分的相关研究发现，外泌体内含有41 860种蛋白质、2 838种miRNA、3 408种mRNA，复杂多样的内容物是外泌体生物学功能的体现，故外泌体特征分析在癌症的早期诊断、治疗、组织器官的缺血再灌注损伤、修复等方面作用的研究不断增加，在机体抗感染免疫中的作用机制研究亦是热点[19]。研究显示，细菌感染时免疫细胞如巨噬细胞(macrophage，M φ)或者树突状细胞(dendritic cell，DC)来源的外泌体携带菌体相关的抗原以及免疫细胞表达的信号分子，如MHC分子、CD63、CD80、CD86等，参与了机体的抗感染过程。当感染肺炎链球菌时，DCs来源的外泌体携带有链球菌的荚膜多糖，与佐剂一起可诱导小鼠产生保护性抗体，发挥一定的免疫保护效应[20]。Nudel等[21]发现，淋病奈瑟菌感染后的子宫上皮细胞分泌的外泌体中含有cIAP2，可诱导子宫上皮细胞发生凋亡。结核菌感染中，巨噬细胞和树突状细胞的功能受到抑制，尤其是其抗原提呈功能减弱，但是T细胞的活化却不受影响。Smith等[22]采用部分功能缺陷Rab27a小鼠作为研究对象发现，外泌体可以运输结核菌蛋白，发挥抗原运输和信息传递功能，激活T细胞，诱导强烈的免疫应答。相同的结果也在外泌体运输肿瘤相关抗原研究中被证实。
结核菌的成分很复杂，尤其是脂质成分丰富，与细菌毒力密切相关。外泌体作为生物信号的传递媒介变化显著，尤其在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染后，许多来源的外泌体所含有的内容物都会发生改变，包括mRNA、miRNA和一些蛋白质成分，这些均有助于更好地理解结核病发病的分子机制。如研究发现MTB感染的巨噬细胞来源的外泌体所携带的miRNA较未被感染细胞来源的外泌体数量显著减少，而mRNA数量显著增多并具有特征性变化，且主要是与免疫抑制效应和诱导受体细胞凋亡相关。已知在被MTB感染后，患者的外泌体中的miRNA虽然释放减少，但被释放的miRNA多数是与免疫有关，如miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-145、miRNA-21等[23-26]。
本研究试图探讨外泌体miRNA的变化特征在临床应用的价值，故在前期研究的基础上验证已筛选的几个有显著变化差异的miRNA以进行下一步分析。通过扩大样本量，进一步收集结核性胸膜炎患者和一般性细菌性肺炎合并炎性胸水患者的样本，以健康体检者为对照组，分析外泌体中miRNA的相对表达量的变化。结果显示：初步筛选的13个miRNA在一般性肺炎患者血清外泌体中的表达水平明显高于健康对照者，而结核性胸膜炎患者血清外泌体中miRNA的表达水平升高得更明显，提示外泌体miRNA可能与疾病发病有关；另外结核性胸膜炎患者胸水外泌体中有变化的6种miRNA在血清中也有变化，且血清中变化的miRNA种类更多，提示结核性胸膜炎患者患病后，血清比胸水先出现miRNA水平的变化，可为临床早期诊断提供新思路。研究还发现，在一般性肺炎患者血清外泌体中升高明显的miRNA有let-7a-5p、let-7c-5p、let-7i-5p和miRNA-126-3p，而结核性胸膜炎患者血清外泌体升高更为明显的有let-7a-5p、let-7d-5p、let-7e-5p、miRNA-126-3p、let-7g-5p和let-7c-5p；并且分析的13个miRNA在结核性胸膜炎患者胸水外泌体中及一般性肺炎合并炎性胸水外泌体中也存在差异性表达，如let-7f-5p、let-7g-5p、let-7d-3p，基本上属于Let-7家族成员。再者，在结核性胸膜炎患者胸水和血清外泌体中miRNA表达也存在显著差异，但这种差异性并没有规律，可能与纳入的病例较少、数据可能存在偏倚有关，未来可扩大样本量并在不同方法学比较研究中验证和分析。
miRNA-Let-7家族目前已发现有10多个成员，最早是在人体中发现。随着研究的深入，有研究发现Let-7家族成员除了参与癌症的发生发展之外，还参与机体的免疫应答反应，与多种病原体感染相关，如幽门螺杆菌感染时机体的let-7b水平降低，同时toll样受体4(toll-like receptor，TLR4)的表达上调，NF- κ B通路被激活导致炎症反应[27]，所以曾有学者认为let-7表达水平检测可以用于胃炎活动性和严重程度的评分判断[28]。肺炎克雷伯菌感染时miRNA-let-7水平上调，高水平的let-7可以减少泛素化限制炎症反应，同时增加细菌在巨噬细胞内存活的概率从而促进了感染[29]。此外，寄生虫如包虫感染导致的囊状包虫病(cystic echinococcosis，CE) 患者中，血清寄生虫来源的let-7-5p水平显著升高，研究者也提出let-7指标结合其他标志物可以作为包虫病分期的特异性诊断标志物[30]。除了细菌、寄生虫感染，病毒感染相关研究也显示Let-7家族miRNA与疾病的临床进展和发病机制相关，如感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)时，Let-7家族miRNA可以通过直接靶向病毒基因组的3’ UTR和调控IL-6的表达去抑制病毒复制[31]。另外，人体感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的相关研究分析发现，let-7的水平与病毒载量存在负相关关系[32]。可见，Let-7家族miRNA确实参与了机体免疫应答反应。
综上所述，本研究筛选验证的miRNA在结核性胸膜炎患者的胸水和血清外泌体中存在差异性表达，与前期研究基本一致[33]，但本研究发现的某些miRNA在一般性肺炎患者和结核性胸膜炎患者外泌体中有相同的变化趋势，只是在结核性胸膜炎患者中变化更明显，也有miRNA在2种疾病中变化趋势相反，这些变化的miRNA具体的临床应用价值，须进一步扩大样本量和跟踪治疗变化等后续分析来确定。综合其他研究和本研究的结果，可知外泌体miRNA参与了结核性胸膜炎疾病的发生、发展过程，尤其是hsm-let-7家族成员，可能可以作为结核性胸水与一般炎性胸水的鉴别诊断指标，但尚不能确定这些miRNA在胸水和血清外泌体中出现的先后关系，以及可能需要达到一定的阈值才能体现诊断价值，尤其是let-7在结核病的发生、发展过程中的机制仍有待进一步研究。
| [1] |
Gao S, Wang C, Yu X, Teng TL, Shang YY, Jia JN, Dong LL, Zhao LP, Liu SK, Chu NH, Huang HR. Xpert MTB/RIF Ultra enhanced tuberculous pleurisy diagnosis for patients with unexplained exudative pleural effusion who underwent a pleural biopsy via thoracoscopy: a prospective cohort study[J]. Int J Infect Dis, 2021, 106: 370-375.
[DOI]
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