病毒性脑(膜)炎是由病毒感染引起的中枢神经系统炎症性疾病。病毒性脑炎主要指病毒感染脑实质而引起其炎症性病变。病毒性脑膜炎主要指病毒累及软脑膜使其出现弥漫性炎症,是无菌性脑膜炎最常见的形式。这种炎症性疾病常表现为精神状态改变、急性发热、癫痫发作、神经功能障碍、脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)细胞增多、神经成像和脑电图(electroencephalogram,EEG)异常[1]。截至2015年的世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的调查显示,全球每10万人中就有约3.5~7.4人诊断为病毒性脑(膜)炎,WHO称预计全球每年未报告的病例远高于每年收到的20万确诊病例。世界各国引起病毒性脑(膜)炎的病原体分布情况各不相同,据统计国内外报道约130多种病毒可引起脑(膜)炎[2],最常见的病原体是疱疹病毒1型(herpesvirus type 1,HSV-1)和疱疹病毒2型(herpesvirus type 2,HSV-2)、非脊髓灰质炎肠道病毒和虫媒病毒[3]。其他相关的病原体包括季节性流感病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、人类疱疹病毒6型(human herpesvirus type 6,HHV-6)和麻疹病毒等[4]。病毒性脑(膜)炎的住院中位费用高达数万美元。美国每年有约6 000例患者因病毒性脑(膜)炎住院,总费用约3.5亿~5.4亿美元,对全球公共卫生构成了严重威胁[5]。
病毒性脑(膜)炎与自身免疫性脑(膜)炎、结核性脑(膜)炎等其他类型的脑(膜)炎临床表现及实验室检查结果相近,精准的诊断可以帮助排除其他可能性,避免误诊,减少不必要的治疗和医疗资源的浪费[6]。不同类型的病毒引起的脑(膜)炎可能需要不同的治疗方法,通过精准诊断,可以更好地了解病原体的种类,从而制定更个体化、针对性的治疗方案,提高治疗效果[7]。病毒性脑(膜)炎的预后与早期治疗密切相关,及时明确诊断并采取有效的治疗措施可以减轻疾病的严重程度,降低并发症风险,从而改善患者的预后[8]。病毒性脑(膜)炎的及时诊断不仅有助于治疗患者本身,也可以采取措施阻断病毒的传播途径,减少疾病在社区中的扩散[9]。因而病毒性脑(膜)炎的精准诊断对提供及时、有效的治疗和改善患者预后至关重要。
由于传统诊断方法的灵敏性及特异性低、耗时长以及抗生素的滥用,仍有40%~60% 的脑(膜)炎患者没有明确的中枢神经系统疾病病因[10]。虽然分子诊断技术提高了检测的灵敏度和特异性,但其仍然受到技术、检测试剂、样本类型、检测时间窗口、成本效益、技术标准化等因素的限制[11]。采用合适的检测手段和规范的诊断技术,对于病毒性脑(膜)炎的快速诊治与疾病防控至关重要[12]。
1 病原学诊断进展 1.1 标本采集应尽量在病程早期、使用药物前采集CSF标本,主要用于病毒核酸检测,血清标本则主要用于抗体的测定,尽量采集患者急性期、恢复期的双份血清[11]。因病毒可合并累及不同的器官,从而合并不同的临床表现,据患者临床表现选择其他标本类型,如出现呼吸道症状时,可采集鼻咽拭子或肺泡灌洗液,出现腹泻、腹痛等症状时,可采集粪便标本[11]。合理选择标本类型,送检标本准备须规范化操作,同时遵循试剂的适用范围。
1.2 病原诊断病原诊断主要包括病毒分离培养、核酸检测和抗体检测。病毒分离培养曾作为诊断的金标准,但因病毒培养难度大,生长周期长,部分病毒无法在常规细胞培养基中繁殖而逐渐减少应用此项技术。IgM抗体在感染急性期出现,可在血清中持续存在,其假阳性率较高,可达10%~20%;抗病毒抗体IgG滴度升高4倍以上具有回顾性诊断意义,但对病毒性脑(膜)炎在急性期的确诊缺少临床实用性[13]。近年来,病毒性脑(膜)炎的病原核酸诊断分子生物学技术突飞猛进。
1.2.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)PCR是一种用于体外扩增特定DNA目标序列的重要技术。在病毒感染的急性期,应用PCR技术对CSF样本进行病毒核酸的扩增和检测,已经成为病毒性脑(膜)炎CSF检测的优先选择[14]。目前,PCR技术已由第1代普通PCR、第2代实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)发展至第3代数字PCR(digital PCR,dPCR)。
PCR、qPCR用于检测DNA病毒(如疱疹病毒、艾滋病病毒),反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)、定量反转录PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR,qRT-PCR)用于检测RNA病毒(如肠道病毒、乙脑病毒)[15]。与DNA病毒相比,RNA病毒遗传物质的丰度相对较低且易于降解,故RNA病毒检出率低[16]。相比传统的绝对定性的普通PCR,qPCR能够提供更精确的结果,2022年Zhang等[17]建立了一种用于快速鉴定和检测日本脑(膜)炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和GETV病毒(Getah virus) 的一步法双工TaqMan RT-qPCR。利用该方法可以在1 h内完成对JEV和GETV的检测和鉴别。在野外蚊子和猪样本中检测JEV和GETV的灵敏度分别是使用传统PCR方法的100倍和10倍[17]。qPCR在获得可靠定量结果方面不断进步,2010年Taylor等[18]介绍了MIQE标准, 提高了qPCR试验结果的可靠性。第1、2代PCR技术因具有灵敏度高、特异性高、快速、方便和自动化等优点,已广泛应用于病毒性脑(膜)炎的病因初筛。第1、2代PCR技术对于低拷贝的DNA往往难以检测,样本中的抑制剂可能抑制反应,从而影响定量结果[19],不同目标序列和仪器系统所产生的结果存在一定的差异,并不具备可比性[20]。
为提高检测的特异性、灵敏性、准确性,并增强抗干扰能力,第3代数字PCR应运而生。2016年,Giovannelli等[21]使用连续稀释的JCPyV-DNA对微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)的准确性进行了研究,通过ddPCR对150例CSF和100例血清样本进行了JCPyV-DNA定量检测和qPCR确认,在13% 的CSF和50% 的血清样本中检测到JCPyV-DNA,在病毒性脑(膜)炎等疾病的诊断方面具有重要的应用潜力。Wu等[22]对JEV患者进行RT-ddPCR和qRT-PCR的线性关系、检出限和特异性进行比较,RT-ddPCR灵敏度是qRT-PCR的100倍,阳性检出率(27.2%)高于qRT-PCR阳性检出率(16.5%)。然而,ddPCR仪器和试剂盒价格昂贵,每次反应成本高,需仪器配套专用消耗品,同时对样本的质量和纯度要求较高,目前仅能进行靶向基因的定量分析,通量较低,且操作过程较复杂,须配备专业技术人员[23],因此限制了其推广应用。
为解决检测耗时长、操作复杂等问题,一体化平台进行了多元化发展。多重PCR (multiplex PCR,mPCR)与常规PCR相比包含多重引物,可对多靶点一起检测,故更为快捷、简单。2015年获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的FilmArray,是一种使用mPCR法同时检测CSF中14种病原体的分子诊断试剂盒,可以在不到一小时内检测各种病毒、细菌和真菌病原体,显著缩短了诊断时长[24]。与病原体培养的金标准相比,FilmArray诊断各种病原体的敏感度为90%,特异度为97%[25]。但PCR仅限于对已知病原体的检测,不能检测未知的感染因子。
1.2.2 宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)mNGS又被称为深度测序技术或高通量测序,是一种不基于培养直接对临床样本中的核酸进行高通量测序、数据库比对和智能化算法分析,无偏性地获得疑似致病微生物的种属信息及其他信息的技术。自2014年美国加州大学第1次通过mNGS诊断神经感染病例[26]起,多个高质量的临床研究及大量复杂的病例报道均已表明,mNGS有能力成为中枢神经系统感染性疾病的诊断工具。
Miller等[27]的研究表明,与常规微生物学测试相比,mNGS在识别致病病原体方面具有92%的敏感性和96%的特异性。应用mNGS可使CNS感染的诊断率提高约25%[28]。mNGS半定量价值进一步协助评估病情,Lascano等[28]通过mNGS监测不同时间点CSF样本的病毒相对丰度,发现其与患者病情的严重程度正相关。mNGS技术可在没有任何先验知识的情况下检测生物标本中存在的任何微生物核酸目标序列,使得无靶向的病原体筛查成为可能[30]。2015年,德国Naccache等[29]首次通过mNGS在3例基底节脑(膜)炎患者的脑内检测到松鼠博尔纳病毒,证实了松鼠博尔纳病毒可传染人类致病。此外,mNGS帮助破译了COVID-19的核酸序列[31],有助于后续疫苗的研究。我国也于2020年制定了临床应用mNGS技术检测感染病原体的专家共识[32]。
然而,mNGS也存在局限性。mNGS阅读核酸序列相对较短,为解决这一问题,3代测序技术Nanopore测序应运而生。Nanopore测序使用纳米孔来读取DNA或RNA分子,当DNA或RNA穿过这个孔时导致电流变化,从而直接读取序列信息,可以实时、快速实现对超过数千碱基对的长读取[33],具有广泛的应用前景。此外,mNGS设备和试剂成本较高,技术要求高,生物信息学分析复杂,不适用于大规模筛查[34],因仪器昂贵,缺乏专业人才等原因,部分地区医疗体系不支持。受到背景核酸干扰,检出的病毒不一定与疾病直接相关,靶向测序或宿主耗竭方法可能会部分消除此限制[35-37]。报告解读目前暂无绝对的标准指南,尚须进一步完善[38]。结果回报时间长,从收到样品到结果报告平均需要52~69 h[39]。mNGS检出病原体的限度约为1%~10%,对低丰度的病原体检出效果欠佳[34]。质控困难,不同实验室之间的结果可比性差[27]。
1.2.3 其他前沿技术① 全基因组引物放大技术(whole genome amplification):通过扩增样本中的病毒RNA/DNA,使其数量足够进行进一步的测序和分析,有助于鉴定病原体。Wylie等[40]使用全基因组引物放大结合目标捕获富集技术, 成功鉴定了4种病毒性脑(膜)炎病原体。②质谱技术: 如基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometer,MALDI-TOF MS)能根据病毒蛋白质指纹进行鉴定。2014年Indikova等[41]利用MALDI-TOF MS分析鉴定了引起绵羊脑膜炎的无壳根寄生虫运动相关蛋白。③生物传感器技术: 利用特异性生物识别元件可快速检测病毒。2021年Abid等[42]指出,生物传感器技术在新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)诊断中有广阔的应用前景,比如光学生物传感器、电化学传感器、纳米材料增强的传感器等。④CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统:可以识别出外源DNA,并将其切断,沉默外源基因的表达。应用CRISPR/Cas9系统可对病毒基因组进行检测。2020年,Li等[43]利用CRISPR进行了抗病毒基因的筛选。⑤转录组学技术(transcriptomics):使用转录组学技术,可以对病毒性脑(膜)炎患者的脑组织或脑脊液中的基因表达进行分析,从而确定与病毒感染相关的基因表达模式。Smolen等[44]通过RNA测序技术分析脑(膜)炎患者的转录组变化,揭示病毒感染对宿主免疫应答的影响。⑥蛋白质组学技术(proteomics):蛋白质组学技术可以用于分析患者样本中的蛋白质组成和蛋白质表达水平,有助于识别与病毒感染相关的蛋白标记物。2022年Ahmed等[45]探讨了利用CSF蛋白质组学技术研究单纯疱疹病毒等对中枢神经系统的感染。
2 病毒性脑(膜)炎的精准诊断路径为提升病毒性脑(膜)炎的诊断效力,国际脑炎联盟提出了病因检查算法[1],我国也提出了病毒性脑(膜)炎病原体诊断技术应用专家共识[11]。鉴于60%~80%的病毒性脑(膜)炎患者首次就诊发生在基层医疗机构[46],而基层医院因技术条件所限,确诊率低于20%[1],因此制定规范化的病因学诊断路径,实行分级诊断策略尤为必要(见图 1)。
2.1 通过病史、症状体征、常规检测进行初步诊断大多基层医院条件有限,依靠详细询问病史、全面体格检查以及基本的实验室检查进行综合分析, 可以初步确定诊断方向。病史采集是诊治患者的第一步,其重要性毋庸置疑。针对疑似脑(膜)炎患者应注意患者发病的季节、旅居史及当地脑(膜)炎的流行情况、动物接触史、亲友病史等,以及患者的职业、嗜好、饮食、性行为、免疫状态(如是否有HIV感染、免疫抑制等药物使用)等信息。如夏秋季须考虑虫媒病毒脑(膜)炎,东欧、俄罗斯以及我国东北地区须考虑蜱传脑(膜)炎病毒脑(膜)炎,有冶游史须考虑HIV脑(膜)炎或梅毒脑(膜)炎,动物咬伤史须考虑狂犬疫苗脑(膜)炎等。大多数神经系统症状在各种脑(膜)炎类型间差异不大,病毒可合并累及肝脏、心脏、胃肠、肺等其他器官,从而引起不同器官相关的临床表现、生化、生理功能改变。同时,应进行详细的体格检查、神经系统检查。皮疹或口腔炎有助于识别部分病毒性脑(膜)炎,但特异性不高。病毒性脑(膜)炎可继发于细菌感染,血常规中白细胞水平也可升高,顽固性低钠血症也可见于病脑[47]。病脑患者往往颅压高,CSF淋巴细胞增多,蛋白水平轻度升高,葡萄糖水平常正常。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)可显示脑(膜)炎症病变及局灶损伤,大多正常,但可有特异性表现,MRI显示颞叶异常的成人脑(膜)炎病例中,如患者年龄较大、急性起病、发热、胃肠道症状,较少共济失调和皮疹,其更可能是单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)脑(膜)炎[5]。80%以上患者EEG异常,可见弥漫性高振幅慢波/局灶性癫痫样活动。须持续EEG监测识别非惊厥性发作状态[4]。
2.2 通过常规分子生物学技术进行病原体初筛对于具有可行常规分子生物学技术的县级医院,应根据患者年龄、发病季节、免疫状态等因素,选择在该季节和年龄段患者常见的优势病原体进行检测;对于高度怀疑某一特定病毒感染的病例,应采用单重PCR,覆盖多种病原体的多重PCR检测技术则有助于提高总检出率[11]。如婴儿病毒性脑(膜)炎以肠道病毒、HSV-2和CMV等较常见;儿童及青少年病毒性脑(膜)炎以肠道病毒、HSV-1和HSV-2、EBV、VZV、JEV(夏秋季节)、腮腺炎病毒等较常见;成年和老年人则以HSV-1和HSV-2、VZV和JEV(夏秋季节)等较常见[11]。免疫正常人群初步检测项目包括HSV-1/2、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒和CMV等[5]。
2.3 应用非靶向广覆盖技术mNGS等非靶向广覆盖技术成本及技术要求较高,在县级医院常不作为常规检测。若患者的PCR检测结果阴性,或者PCR不可及,病因不明的慢性中枢神经感染,免疫功能缺陷,怀疑未知、罕见病原体感染的急重症脑(膜)炎,应考虑对其采用mNGS[11]。
2.4 建立多学科团队诊疗模式神经内科、感染科、检验科、影像科、病理科等形成多学科协同合作网络,整合各个学科的专业知识和技能,使得各学科能够共同参与诊断决策,形成高效的团队合作机制,为患者提供全面、专业的医疗服务,最终提高病脑的确诊水平。
2.5 建立临床诊疗网络建立临床诊疗网络,使得各级医疗机构能够共享患者的病历信息、诊断结果和治疗方案。通过信息化手段,如电子病历系统和远程会诊平台,实现医生之间的实时沟通和合作。这有助于提高基层医生对病毒性脑(膜)炎的认识,实现及时而准确的诊断。同时,加强基层医生的技术培训,提高他们对现代诊断技术的应用水平,使得在基层也能够进行有效的初步诊断。加大科研投入,支持基层医疗机构参与相关研究项目。通过科研成果的转化,开发适合基层使用的简易诊断工具,以提高基层医生对病脑的初步判断和筛查能力。这可以包括一些简便易行的检测工具,有助于在基层实现更早期的病因筛查。该分级诊断策略或有助于规范化病因学鉴定流程,实现基层、县级、市级等医疗机构之间的有机衔接,形成一个完整的医疗服务链条,最终提升病毒性脑(膜)炎患者的整体诊疗水平,降低误诊率,改善患者的临床结局。
3 总结与讨论病毒感染已成为脑(膜)炎的重要病因,仅凭临床表现和常规生化指标难以确定病原。病因诊断分子技术已突飞猛进,广泛应用,但须根据不同的临床特征选择合适的诊断技术。优化病脑精准诊断路径,落实分级诊断策略,可提高确诊率。通过结合大数据和知识图谱技术,临床诊疗网络的功能还在不断扩展,将来可望实现“医生的AI助手”的目标,辅助医生进行个体化智慧诊疗。随着病原学诊断技术的进步、对病原病理学认识的深入以及人工智能的发展,病毒性脑(膜)炎诊断可以更加快速、准确地实现。
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