自2019年12月，新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)在中国肆虐，迅速蔓延的疫情严重威胁着人类的生命健康^[1-2]。因此，对2019-nCoV的病原学、致病性及其防治的研究刻不容缓。

冠状病毒是一类有包膜的正链单链RNA病毒，基因组27~32 kb。冠状病毒在系统分类上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，正冠状病毒亚科又包含甲、乙、丙、丁4个属。自然界中，冠状病毒成员众多，宿主广泛，可感染多种禽类和哺乳动物。多数冠状病毒主要导致宿主消化道和呼吸道的感染，临床症状轻微或中等。仅有少数冠状病毒致病性强，可导致宿主产生严重反应甚至死亡^[3]。已知的人类冠状病毒(human coronavirus, HCoV)有6种，甲型冠状病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63及乙型冠状病毒属的HCoV-OC43和HCoV-HKU1主要引起普通感冒和症状较轻的呼吸系统感染，极少引起严重感染；但是，2003年出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和2011年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)均可引起致命的呼吸系统疾病^[4]。2019-nCoV为第7种可感染人的冠状病毒，根据已发布的基因组信息，2019-nCoV属乙型冠状病毒的β亚群，与SARS-CoV全基因组序列同源性约为79.5%，与MERS-CoV基因组的同源性约为40%，与一种蝙蝠中的冠状病毒(bat CoV RaTG13)序列一致性高达96%^[5]。其是否有动物中间宿主还有待研究。

有效的病毒细胞感染模型和动物感染模型，可为疫苗和药物的研发提供支持；也是体外深入认识2019-nCoV的感染特性和致病机制的关键，可为临床诊疗方案的制订和完善提供基础数据支撑。而这些模型的构建以及后续研究的开展均依赖感染性良好的病毒株。目前，国内仅少数几个实验室成功分离到能够稳定传代的2019-nCoV毒株，但毒株的感染效率和复制能力尚不理想^{[1, 5]}。本研究通过优化2019-nCoV的分离、培养条件，从上海市确诊感染者的临床样本中成功分离到1株2019-nCoV，命名为nCoV-SH01。

1 材料与方法 1.1 材料

临床样本：10份临床确诊的COVID-19患者鼻/咽拭子(1~10号标本)，由上海市疾病预防控制中心提供，经实验室聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)重复检测，其中3、6、10号病毒核酸阳性。COVID-19康复期患者血清和健康人血清由本实验室保存。Vero E6细胞、Huh-7细胞株由本实验室保存。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

Vero E6和Huh-7细胞培养采用含10%胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM培养液(Hyclone公司)，置5% CO₂、37 ℃中培养。

1.2.2 病毒分离和培养

操作在P3实验室中进行。将状态良好的Vero E6和Huh-7细胞分别接种于96孔细胞培养板，培养24 h后备用。

冻存的鼻/咽拭子标本放置于冰上升温而融化。弃96孔细胞培养板中培养液，每孔加入标本液25 μL；每个标本分别接种2类细胞系。另外，每个细胞系设2个对照孔，每孔仅加入25 μL维持液。将接种好的细胞培养板于5% CO₂、37 ℃培养箱中孵育2 h。然后弃接种的标本液，每孔加入100 μL DMEM维持液〔(含胰酶16 μ g/mL，1%青、链霉素(Hyclone公司，Hyclone SV30010)〕, 放置5% CO₂、37 ℃培养箱中继续培养，每日观察细胞病变。如有细胞病变，则在80%以上细胞单层被破坏时，收取细胞培养物。对没有出现的病变细胞，收取上清液，按类似方法盲传2代，并对细胞培养物进行实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，荧光定量RT-PCR)检测。

1.2.3 RNA提取及荧光定量RT-PCR检测

使用300 μL Trizol LS(Invitrogen公司)充分裂解细胞培养物(100 μL)。加入80 μL氯仿，混匀静置室温10 min后，13 000 g离心15 min。取上清液250 μL，加入2 μL Glycoblue和250 μL异丙醇，混匀后13 000 g离心15 min；弃上清液，加入500 μL 75%乙醇，13 000 g离心5 min，洗涤蓝色沉淀；弃上清液，沉淀物于室温干燥5 min，加入10 μL RNA free水重悬。

取5 μL提取的RNA，采用双重荧光PCR检测样本或细胞培养物中的2019-nCoV核酸。具体操作按照“2019-nCoV(ORF1ab/N基因)核酸检测试剂盒”(上海伯杰公司，货号：SJ-HX-226-2)说明书进行。

1.2.4 病毒基因组测序及分析

取5 μL RNA，利用反转录酶SSⅢ试剂盒(Invitrogen公司)进行cDNA合成，根据试剂盒说明书采用随机引物进行反转录反应，合成cDNA。送上海伯豪生物技术有限公司进行二代Illumina法测序。同时，设计合成20对引物，利用高保真酶SuperFi DNA Polymerase (Invitrogen公司)对分离毒株的基因序列进行PCR扩增。PCR体系：混合35 μL ddH₂O、10 μL 5×PCR Buffer、1 μL dNTP (10 mmol/L)、1 μL Taq酶，加入特异性上、下游引物各1 μL(10 μ M)和1 μL cDNA。反应程序：94 ℃ 5 min；(94 ℃ 30 s、52 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物胶回收后，送上海百力格生物技术有限公司进行一代Sanger法测序。测序后经拼接得到病毒的基因组全长序列并使用DNAStar7.1软件，将其与GenBank中已经发布的2019-nCoV序列进行比对分析。

1.2.5 免疫荧光实验

经polylysine处理的玻片置于24孔板中，接种状态良好的Vero E6细胞，放置5% CO₂、37 ℃培养箱中培养24 h；至玻片中细胞汇合度约80%时，将产生疑似细胞病变的第1代细胞培养上清液接种于玻片上培养的Vero E6细胞，置5% CO₂、37 ℃中继续培养18 h。单层细胞用冷磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗3遍，4%多聚甲醛(Sigma公司)室温固定30 min；PBS洗涤3遍，加入封闭缓冲液(含5% BSA和0.5% TX-100的PBS)封闭1 h；PBS洗涤3遍，加入由封闭缓冲液100倍稀释的COVID-19的康复者血清，室温孵育1 h，同时设健康人血清作为对照；用PBS洗涤3遍，再加入FITC标记的羊抗人荧光二抗(Thermo公司)，室温孵育1 h；用PBS洗涤3遍；最后与4 ′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)孵育10 min，PBS洗涤细胞玻片3遍。荧光显微镜(AMG公司)下观察结果。

2 结果 2.1 细胞分离培养及细胞病变

将10份鼻/咽拭子(SCDC-1~10)标本分别接种Vero E6和Huh-7细胞，24、48、72和96 h后观察细胞病变。结果显示，10号标本(SCDC-10)接种的Vero E6细胞48h后出现疑似合胞体的病变，至72 h，细胞几乎全部脱落、死亡。收获该样本的细胞培养物(下称SCDC-10-P1)。而其他标本接种的Vero E6和Huh-7细胞，连续4 d均未观察到有明显的细胞病变。

从收获的SCDC-10-P1提取RNA，进行RT-PCR检测及测序分析。同时，将细胞培养上清液继续接种于Vero E6细胞进行扩增。结果显示，在24 h后即可观察到明显的合胞体病变，48 h后细胞几乎全部脱落、死亡(图 1)。证明该标本中存在病毒，且其可在Vero E6细胞中快速复制。现将该病毒暂命名为nCoV-SH01。

其他标本即使未引起可疑的细胞病变，也于接种96 h后收集细胞，用TRIZOL裂解，用荧光定量RT-PCR检测2019-nCoV核酸；收获的细胞上清液，继续接种Vero E6和Huh-7细胞进行盲传。结果显示，连续盲传3 d仍未出现明显的细胞病变。荧光定量RT-PCR也未检测到病毒核酸。

2.2 荧光定量RT-PCR检测到SCDC-10的循环阈值明显降低

为确定2019-nCoV是否可在相应细胞中复制，利用“2019新型冠状病毒(ORF1ab/N基因)核酸检测试剂盒”对第1代和第2代细胞培养物进行检测和对比分析。结果显示，10号标本(SCDC-10)的荧光定量RT-PCR的循环阈(cycle threshold，CT)值为35.52，接近检测临界值。接种Vero E6细胞后，SCDC-10-P1荧光定量RT-PCR检测的CT值明显降低(图 2)，提示细胞内2019-nCoV核酸量显著增加。除在SCDC-3接种的Huh-7细胞中可检出病毒核酸外，其他样本均未检测到(数据未显示)。SCDC-3检出的CT值明显高于其原始标本，提示病毒没有发生增殖，怀疑为接种后残留的RNA而非病毒复制所致。对所有10个样本盲传第2代所收获的Vero E6细胞和Huh7细胞培养物进行检测，结果显示，只有SCDC-10为阳性，其他样本全部为阴性(数据未显示)。说明，在SCDC-10接种的Vero E6和Huh-7细胞中均有2019-nCoV核酸复制。

2.3 测序结果与分析

通过二代Illumina和一代Sanger法测序，分别获得了该分离毒株的全基因组序列，经比对分析，2种测序方法得到的序列完全一致。利用DNAStar7.1将该序列与GenBank已经公开的2019-nCoV毒株基因组全长序列进行比对分析，同源性＞99.99%。测序结果显示，nCoV-SH01与最早分离的2019-nCoV Wuhan-Hu-1株高度同源。

2.4 免疫荧光法检测结果

为进一步确认SCDC-10-P1中有2019-nCoV复制及Vero E6细胞上的细胞病变与2019-nCoV感染相关，采用免疫荧光染色法，用1份来自COVID-19康复者的血清对SCDC-10感染的细胞进行检测，并设立了健康人血清对照和未感染病毒的正常细胞对照，以排除假阳性结果。结果显示，仅康复者的血清与SCDC-10的细胞呈阳性反应，且与细胞病变部位高度重合(图 3)。结果提示，SCDC-10接种后，细胞呈现的病变与2019-nCoV高度相关，细胞中存在2019-nCoV感染和相关病毒抗原的表达。

3 讨论

上述致细胞病变效应、序列分析及免疫荧光检测所示结果充分证实已经成功分离并鉴定出1株2019-nCoV。鉴于该毒株为上海市成功分离的首个2019-nCoV毒株，因此将其正式命名为nCoV-SH01。该毒株在Vero E6细胞中复制迅速，可形成典型的合胞体病变，且病毒的滴度较高。序列分析发现nCoV-SH01毒株与早期分离的Wuhan-Hu-1株高度同源也说明病毒在传播过程中，其基因组相对稳定。

冠状病毒的分离比较困难，主要原因在于病毒与细胞受体结合并介导入侵的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)比较大，且容易脱落或被破坏^[6]。标本采集后，在保存、运输及冻融、离心等过程中，刺突(spike, S)蛋白易脱落，会降低病毒分离、培养的成功率^[7]。某些冠状病毒尤其是乙型冠状病毒的S蛋白在入侵时需要被蛋白酶切割成S1和S2两个部分，因此，在分离、培养时适当使用胰酶处理可提高病毒的分离成功率^[8]。胰酶可能促进了S蛋白的切割，使病毒更易在细胞间通过膜融合扩散，从而也更易形成合胞体^[9-10]。另外，分离病毒所用的细胞系也非常关键，敏感细胞系和良好的细胞状态也是分离成功的关键。因此，在该病毒的分离、鉴定过程中，我们综合考虑了以上因素，选用了文献报道的敏感细胞系Vero E6和Huh-7细胞。对培养体系进行了优化，加入适量的胰酶，同时添加高效的抗生素以抑制可能的细菌和支原体污染，这可能是从低滴度标本中分离病毒的关键。结果在Vero E6细胞上成功分离到新型冠状病毒，且病毒可形成典型的合胞体病变。而在Huh-7细胞上虽然存在病毒核酸复制，但未观察到明显的细胞病变，也提示在不同细胞系上病毒的复制和对细胞的致病性具有差异。

有趣的是在临床标本中核酸的拷贝数高并不意味着病毒的分离率高。在1~10号鼻/咽拭子标本中，SCDC-3核酸拷贝数最高，CT值最小；而SCDC-10的CT值接近检测临界值，但却从10号样本中分离到病毒。推测采样时间、运输、保存条件等外界因素均可能影响病毒的易感性。提示在分离、培养条件相同的情况下，标本中是否存在具有感染性的病毒是影响分离成功的关键。

nCoV-SH01在Vero E6细胞中可形成典型的合胞体病变，且细胞病变进展迅速。荧光定量PCR结果提示，其可能具有较高的病毒滴度。nCoV-SH01株在感染后的18 h即可观察到明显的致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)和典型的合胞体病变，提示该毒株在Vero E6细胞上扩增性良好。而以往报道的分离株最早在72 h才能观察到病变^{[1, 5]}。因此，该毒株扩增速度快，致细胞病变能力强。该细胞模型可用于病毒大量扩增和后续相关试验，如抗病毒药物筛选、中和抗体抗病毒检测等病毒学研究。

本研究初步分离到1株新型冠状病毒，对病毒的复制特性、细胞适应性等还待深入研究。该毒株的成功分离将为2019-nCoV致病机制的研究及其相关疫苗、药物的研制提供重要的毒种资源。