草螺菌属(Herbaspirillum) 是双变形菌门的革兰氏阴性非发酵杆菌，严格需氧，没有溶血环，带有极性鞭毛，氧化酶、脲酶和过氧化氢酶阳性。哈特草螺菌(Herbaspirillum huttiense)是草螺菌属的一员，具有相同的生物学特性。虽然已经鉴定和研究了一些草螺菌属的种类，但只有少数哈特草螺菌感染作为人类病原体被报道。本研究中的草螺菌分离自肺腺癌放疗后患者的血液样本，并从细菌分离、鉴定与药物敏感性试验等方面对该菌株进行分析，同时回顾相关文献。

1 材料和方法 1.1 研究对象

患者，男，73岁，因“肺腺癌术后脑转移5月，化疗5周期治疗后3月”入住中国医学科学院肿瘤医院深圳医院。患者2020年1月于外院诊断为“肺腺癌”，并于2022年3月在我院开始化疗，化疗5周期后，查颅脑磁共振成像，提示：左脑出现异常强化灶，边缘清晰，大小约2.9 cm×2.5 cm×2.7 cm。现为求进一步治疗来我院就诊，门诊拟“肺恶性肿瘤”收入院。入院查体：T：36.3 ℃，P：63次/min，R：20次/min，BP：161/89 mmHg。双肺呼吸音正常，未闻及干湿啰音及胸膜摩擦音。入院完善相关检查后予以首次放疗，放疗后患者出现发热，体温最高达39 ℃，查血小板压积(plateletcrit，PCT)：0.959 ng/mL，C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)：7.42 mg/L，白细胞计数为8.84×10⁹/L，中性粒细胞百分比为96.9%，并行外周、输液港需氧血培养检查。分别于20.8 h、14.1 h后需氧瓶报阳，经质谱仪鉴定为哈特草螺菌，临床予以亚胺培南抗感染治疗8天后，患者血常规(白细胞、中性粒细胞)、CRP指标值已恢复正常，但PCT稍偏高，临床更换抗菌药物为头孢哌酮舒巴坦。患者体温恢复正常，并完成一周期放疗后出院。

1.2 方法 1.2.1 细菌涂片与培养

严格无菌操作，分别从留置导管和外周静脉抽取患者血液各10 mL注入2套血培养瓶(上海梅里埃)，即刻放于Bact/ALERT 3D全自动血培养监测系统(上海梅里埃)孵育。血培养瓶报阳后，抽取血培养瓶中的培养液进行涂片、革兰氏染色、镜下观察；取阳性培养液接种于血平板、巧克力平板、麦康凯平板，并置于普通孵箱，培养24 h。

1.2.2 质谱仪鉴定

用1 μL接种环挑取单个适量菌落均匀涂于靶板，干燥后加1 μL CHCA基质液，待其干燥后将靶板载入VITEK MS质谱仪，在电磁场的作用下，离子聚焦在不同位置，从而获得相应的质谱图，并将质谱图传至相应的分析软件进行鉴定分析。

1.2.3 VITEK 2 Compact仪器鉴定与药敏试验

用无菌拭子挑取1~2个新鲜纯菌落至3 mL盐水管中，混匀后置于比浊仪上比浊，使浊度在0.50~0.63麦氏单位，选择GN鉴定卡、N335药敏卡进行鉴定与药敏分析。

1.2.4 16S rDNA PCR检测及测序

按照Qiagen细菌DNA提取试剂盒说明书(北京天根生化科技公司)提取细菌基因组DNA，扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果与NCBI BLAST数据库进行比对分析。

1.2.5 基因组测序

采用Illumina和PacBio相结合的方式进行基因组测序。使用Canu 1.3分析软件对第3代测序reads进行拼接组装，并通过PrInSeS-G 1.0.0软件进行序列矫正；利用RAST软件对组装的序列数据进行基因注释；利用ResFinder 4.1对耐药基因和毒力基因进行分析，或者使用BLAST把基因蛋白序列与CARD(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)、VFDB(Virulence Factors of Database)数据库进行比对，将基因和其相对应的耐药、毒力因子功能注释信息结合起来，从而得到注释结果。

2 结果 2.1 菌落及镜下形态

分别采集患者外周、输液港血液注入需氧瓶，行全自动血培养监测，分别于20.8 h、14.1 h后报阳，立即取阳性血液接种于血平板、巧克力平板、麦康凯平板，并置于普通孵箱，培养24 h后，可见1~1.5 mm大小、白色、胶状和稍微隆起的菌落，没有明显的溶血环(见图 1)。挑取单个菌落进行涂片、革兰氏染色，镜下见革兰氏阴性杆菌(见图 2)。

2.2 病原菌鉴定 2.2.1 质谱仪鉴定

分离菌经VITEK MS质谱仪鉴定为哈特草螺菌，置信度为99.9%，如图 3所示。

2.2.2 VITEK 2 Compact鉴定

经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统GN卡鉴定为洋葱伯克霍尔德，可信度为89%，生物编码为7543401403500001，如图 4所示。

2.2.3 分子测序

基因组序列结果显示，染色体大小为5 616 186 bp，G+C含量为62.67 %；蛋白质编码基因4 999个，其中包含154个毒力致病因子和78个抗生素耐药性相关基因。在VFDB数据库中鉴定出的毒力致病因子，包括鞭毛、荚膜、菌毛和黏附聚集因子等。在CARD数据库中检测到β-内酰胺酶类、氟喹诺酮类、大环内酯类、多粘菌素类等抗生素耐药相关基因和多药外排系统蛋白等。将16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果与Herbaspirillum huttiense strain NFYY 53159(序列号为CP037993)具有较高的同源性，达99.69%。

2.3 药敏试验

参照临床实验标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2022版对非发酵菌的要求，采用N335药敏卡片进行药敏实验。药敏结果显示：该菌株对氨曲南中介，MIC值为16 μg/mL；对其余抗生素均敏感，包括阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林他唑巴坦、亚胺培南、美洛培南、头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、头孢吡肟、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、多西环素、米诺环素、替加环素和复方新诺明。具体如表 1所示。

3 文献报道草螺菌感染情况汇总分析

经过全面的文献检索，发现草螺菌是一种能够引起人类感染的罕见病原菌。分别在PubMed/Geen Medical/中国知网/万方数据库等数据库进行哈特草螺菌(H. huttiense)相关研究的检索，检索出近年来哈特草螺菌感染相关中英文病例报道共14例，分别来自美国(3例)、中国(3例报道)、西班牙(4例报道)、土耳其(2例报道)、韩国(1例报道)、赤道几内亚(非洲)(1例)。其中标本来源13例来自血液，1例来自痰液。具体如表 2所示。

4 讨论

草螺菌属是一种需氧、非发酵的革兰氏阴性杆菌，存在于自然环境中，偶尔会引起人类的机会性感染，许多环境微生物已经进化成人类的病原体，哈特草螺菌是其中之一。过去，由于其系统发育和表型与其他菌株相似，包括伯克霍尔德菌属、拉尔斯顿菌属和其他与植物有关的属^{[5, 11]}，导致VITEK 2 Compact等生化鉴定系统无法准确鉴定出该菌，因此哈特草螺菌极其容易被误鉴定，从而阻碍了人们对哈特草螺菌的认识。根据检索的文献报道^[1-11]，病例大多来自欧洲，其次是美洲和亚洲，非洲没有相关病例报告(表 2中非洲病例的患者是在西班牙旅游时被检出哈特草螺菌)，很可能是由于缺乏技术资源而导致的区域差异。本实验室VITEK 2 Compact仪器的GN卡也将该菌株错误鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，因此当仪器鉴定准确度不是特别高时，不应完全相信仪器结果，须多种鉴定方法联合应用，从而提高对该菌鉴定的准确性。

近年来，MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight，基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱技术在临床微生物学中的广泛应用，在很大程度上提高了对细菌和真菌的鉴定准确性。MALDI-TOF质谱技术主要是利用微生物核糖体蛋白表达上的差异进行区分，通过测定其特征性的蛋白指纹图谱，并与数据库中已知微生物的质谱峰进行比对，从而对病原菌进行鉴定^[12]。目前梅里埃VITEK MS(数据库3.2)临床数据库涵盖了1 361种菌种，较于传统基于生化反应的鉴定系统，其提升了对于菌种鉴定的能力。在已报道的病例中^[1-11]，其中4例(4/14)采用Bruker系统、5例(5/14)采用VITEK MS系统、8例(8/14)采用16S rDNA测序进行鉴定。本研究采用VITEK MS质谱仪进行鉴定，鉴定结果为哈特草螺菌，且置信度为99.9%，结果可靠。此外，本研究通过PCR方法扩增该菌的DNA测序，且将测序结果与NCBI Genbank数据库进行比对，发现该菌与哈特草螺菌高度同源，也证实了质谱鉴定的准确性。

本研究通过高通量测序技术，准确鉴定出了该菌株的全基因序列，发现该菌株含有154个毒力相关基因和多种编码鞭毛相关蛋白的基因。通常鞭毛运动具有化学趋向性，使细菌趋向营养物质，而逃离有害物质，而且能协助细菌快速吸附到细胞上，从而促进了细菌对宿主的入侵。本研究中的哈特草螺菌的毒力可能与鞭毛有关。此外，本文还发现该菌株携带78个耐药基因，其中多药耐药相关基因占优势，表明哈特草螺菌可能携带多药耐药相关基因。有研究者指出，多药耐药基因的高度表达可导致肿瘤细胞对多种药物产生不同程度的耐药，从而严重影响化疗疗效^[13-15]。此外，他们认为多药耐药基因的表达量与耐药程度呈正相关，因此可以通过检测多药耐药基因的表达量来预测患者对化疗的反应，从而有针对性地选择有效的化疗药物，提高化疗疗效和治愈率。

研究表明，哈特草螺菌感染通常与肺炎、肿瘤、血液系统疾病、心血管疾病等危险因素相关^{[4, 16]}。上述相关案例^[1-11]显示哈特草螺菌主要分离自血液标本，仅一例分离自痰液标本。本研究的分离株分离自肿瘤患者的血液标本，该患者正处于放疗阶段，机体免疫功能低下，使得条件致病菌哈特草螺菌进入机体，侵入血液，造成血流感染。由于目前关于哈特草螺菌感染的报道较少，CLSI没有推荐的常规药物敏感性试验方法和折点判读，因此本文参考非发酵菌的要求进行药敏实验。此时，经验性治疗在临床中发挥了重要作用。本例患者临床经验性采用亚胺培南西司他丁钠进行抗感染治疗，当患者病情改善时，改为头孢哌酮/舒巴坦钠继续治疗，最后患者表现出良好的临床反应。此外，也有相关研究显示，美洛培南和哌拉西林/他唑巴坦治疗哈特草螺菌感染具有较好的疗效^[16-17]。

综上所述，微生物工作者应重视哈特草螺菌导致的感染，不可轻易认为是污染菌。随着技术的不断更新，多种诊断技术联合使用可提高对少见菌鉴定的准确性，为临床提供更为准确的鉴定结果。